周 毅，王 偉，姚 遠，楊劍文，盧啟海

（廣西醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院·柳州市人民醫(yī)院 泌尿外科，廣西 柳州545006）

世界范圍內(nèi)，膀胱癌位列男性最常見實體瘤的第四位，在女性位列第七位，每年新診斷的膀胱癌患者超過350000名。近幾年，我國部分城市膀胱癌的發(fā)病率呈現(xiàn)穩(wěn)中有升的趨勢。國內(nèi)大城市中如北京，上海，天津，膀胱癌的發(fā)病率已位列男性常見惡性腫瘤的第六位，而死亡率位列第七位。大部分患者都是因為肉眼或鏡下血尿懷疑膀胱癌而做檢查的；其他一些可能有排尿刺激癥狀，如尿頻、尿急、尿痛；還有一些是由于尿脫落細胞學陽性，或者因為腰背疼痛做CT檢查時發(fā)現(xiàn)膀胱里面有腫塊。本研究通過探討在對膀胱癌的診斷過程中，尿膀胱癌抗原、透明質(zhì)酸和存活素的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1．1 研究對象

本研究共104例患者，其中男79例，女15例，年齡34－79歲，平均66歲。共分兩組，第1組為膀胱癌組：膀胱癌患者74例，男61例，女13例，年齡42－79歲，平均63歲；74例膀胱癌患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實為膀胱移行細胞癌，其中G1 12例、G2 43例、G3 19例，pTa 40例、pT1 21例、pT2及以上13例。行膀胱全切6例，膀胱部分切除12例，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBt）56例。第2組為對照組：泌尿系統(tǒng)良性疾病患者20例，男16例，女4例；年齡32－70歲，平均51歲，包括尿道感染、尿石癥、良性前列腺增生、腎小球腎炎、神經(jīng)原性膀胱、尿道狹窄等。第3組為健康志愿者標本10例，行膀胱鏡檢查前留取清潔中段單次晨尿50－100ml，分組編號，每例尿樣分為4份。膀胱鏡檢查腫瘤部位、大小、數(shù)目，并作腫瘤活檢和隨機活檢。根據(jù)病理進行腫瘤分級和分期。1．2 實驗方法

試驗方法：膀胱鏡檢查或術(shù)前常規(guī)留取晨尿，每例尿樣分4份，分別行膀胱癌抗原（UBC）、透明質(zhì)酸（HA）、存活素（Survivin）和尿脫落細胞學檢查。UBC、HA和Survivin檢測具體實驗步驟參照產(chǎn)品說明書。

1．2．1 UBC：ELISA法檢測 UBC，試劑盒購自瑞典IDLBiotech公司。按照試劑說明書以12μg／L為尿UBC診斷膀胱癌的陽性臨界值。

1．2．2 HA：放射免疫法測定HA，HA放射免疫分析測定盒購自上海海研醫(yī)學生物技術(shù)中心。以大于正常對照組HA上限144．7μg／L為臨界值。

1．2．3 存活素（Survivin）：采用 RT－PCR（TaKaRa公司）方法檢測尿脫落細胞中存活素特異性DNA條帶。RNA提取采用TRIZOL試劑（美國Invitrogen公司）。

存活素 （279bp）外引物：F1：5′－CTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAA－3′，R1：5′－AATAAACCCTGGAAGTGGTGGCA－3′；內(nèi) 引 物：F2：5′－CCGCATCTCTACAT－CAAGAAC－3′，

R2：5′－CTTGGCTCTTTCTCTGTCC－3′，

β－actin （309bp） 引 物：F：5′－AGCGGGAAATCGTGCGTC－3′，

R：5′－CAGGGTACATGGTGGTGCC－3′。由大連寶生物工程有限公司合成。1．2．4 尿脫落細胞檢查：采用吖啶橙染色及HE染色，吖啶橙染色分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級；HE染色分為陰性、輕度核異質(zhì)、中度核異質(zhì)、重度核異質(zhì)、腫瘤細胞5級。吖啶橙染色Ⅲ－Ⅴ級定為陽性，HE染色中度核異質(zhì)、重度核異質(zhì)、腫瘤細胞定為陽性［1］。

1．3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS11．5軟件進行統(tǒng)計學分析，采用方差分析（ANOVA）、χ2檢驗、t檢驗，P＜0．05 表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 健康志愿者、泌尿系統(tǒng)良性疾病患者與膀胱癌患者UBC、HA和尿脫落細胞學檢查的比較 按照試劑說明書以12μg／L為UBC診斷膀胱癌的臨界值，以大于正常對照組尿液 HA水平上限144．7 μg／L為HA陽性界值。

三組患者比較，膀胱癌患者UBC、HA、Survivin和尿脫落細胞學的陽性率分別為86．5%（64／74），89．2%（66／74），93．2%（69／74），40．5%（30／74）；良性泌尿系疾病患者UBC、HA、Survivin和尿脫落細胞學的陽性率分別為 10．0%（2／20），20．0%（4／20），5．0%（1／20），10．0% （2／20）；健 康 志 愿 者UBC、HA、Survivin和尿脫落細胞學的陽性率均為0．0%（0／10），UBC、HA、Survivin和尿脫落細胞學的檢測有利于膀胱癌的診斷，且UBC、HA、Survivin三者的有效性優(yōu)于尿脫落細胞學的檢測。見表1。

表1 三組患者UBC、HA和尿脫落細胞學檢查結(jié)果的比較

2．2 UBC、HA、Survivin和尿脫落細胞學的敏感性、特異性、準確性、陽性預測值、陰性預測值比較

UBC、HA、Survivin在檢測膀胱癌的過程中，三者的敏感性高于尿脫落細胞學，有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），但三者之間的比較無顯著差異，無統(tǒng)計學意義。4種診斷方法在特異性上無顯著差異，但在準確性上 UBC、HA、Survivin分別為62．9%、66．2%、65．2%明顯高于尿脫落細胞學30．8%，有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表2。

表2 4種診斷方法的敏感性、特異性、準確性和陽／陰性預測值的比較

2．3 腫瘤分級、分期、形狀、數(shù)目、是否復發(fā)與UBC、HA、Survivin和尿脫落細胞學檢查敏感性的比較UBC、HA、Survivin在腫瘤的各分級（G1、G2、G3）和各分期（pTa、pT1、≥pT2）中的敏感性明顯高于尿脫落細胞學，且HA、Survivin在G3的敏感性高于G1，有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。UBC、HA、Sur－vivin三者的敏感性在腫瘤的各分期中無顯著性差異。UBC、HA、Survivin在腫瘤單發(fā)／多發(fā)和初發(fā)／復發(fā)中的敏感性明顯高于尿脫落細胞學。三者在腫瘤多發(fā)的敏感性高于單發(fā)，在腫瘤的初發(fā)高于復發(fā)。見表3。

表3 4種診斷方法的敏感性（%）與腫瘤分級、分期、數(shù)目及初／復發(fā)的關(guān)系

3 討論

膀胱癌是指膀胱內(nèi)細胞的惡性過度生長。最常見的過度生長位于膀胱腔內(nèi)，也就是膀胱的粘膜上皮。膀胱的粘膜上皮細胞稱作尿路上皮細胞，由它生成的癌就稱作尿路上皮癌，占到了所有膀胱癌的90%－95%，是最常見的一類膀胱癌。其他不太常見的膀胱癌有鱗狀細胞癌和腺癌。細胞角蛋白（CKS）是分布于上皮細胞的中間纖維絲，屬一類蛋白質(zhì)的多基因家族，可在體內(nèi)形成不溶于水的中間片段，具有上皮來源細胞的特異性［2］。UBC的實質(zhì)即為膀胱腫瘤來源的CK8和CK18片段［3］，因檢測技術(shù)簡便且具較好的靈敏度和特異度，已成為目前診斷膀胱癌應(yīng)用較多的CKS標志。透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid、HA）又名玻尿酸，透明質(zhì)酸是一種酸性粘多糖，1934年美國哥倫比亞大學眼科教授Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出該物質(zhì)。透明質(zhì)酸以其獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，如潤滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，水電解質(zhì)擴散及運轉(zhuǎn)，促進創(chuàng)傷愈合等。HA作為一種葡萄糖氨基酸，其廣泛分部在結(jié)締組織和體液中，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能是其主要的作用。HA與腫瘤的關(guān)系：癌細胞增殖致使HA合成增加；癌細胞浸潤周圍結(jié)締組織導致HA釋放增加；癌細胞作用與其它相關(guān)細胞間接產(chǎn)生HA；HA降解酶抑制物增加，降解受阻。近年來研究表明［4－7］，HA 對膀胱癌具有診斷價值，認為膀胱腫瘤細胞在浸潤過程中釋放的HAase分解組織內(nèi)的HA，分解產(chǎn)物隨尿排出導致尿中HA濃度變化，本研究結(jié)果與前面學者的研究相符［8］。

存活素（Survivin）是1997年發(fā)現(xiàn)的一種抗凋亡蛋白，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein）家族成員。存活素可通過抑制細胞凋亡、調(diào)控細胞周期和促血管形成作用促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Survivin主要分布于胚胎組織及腫瘤，在成人（除胸腺、子宮內(nèi)膜組織、睪丸）大多數(shù)腫瘤組織中Survivin表達水平異常升高［9］。已有研究發(fā)現(xiàn)，Survivin可以作為靈敏特異的膀胱癌早期診斷因子和指導預后的指標，且其與膀胱癌的分級、分期的相關(guān)性也已經(jīng)得到證實。再對膀胱癌的研究過程，人們發(fā)現(xiàn)單一標志物的靈敏度和特異性有不同程度的差異，幾種標志物的聯(lián)合檢測對提高膀胱癌診斷的靈敏度有較大的應(yīng)用價值。因此，本研究聯(lián)合檢測尿膀胱癌抗原、透明質(zhì)酸和存活素在膀胱癌診斷過程中的應(yīng)用價值。

本實驗顯示膀胱癌患者UBC、HA、Survivin和尿脫落細胞學的陽性率均明顯高于良性泌尿系疾病患者和健康志愿者，且UBC、HA、Survivin三者的有效性優(yōu)于尿脫落細胞學的檢測。UBC、HA、Survivin在檢測膀胱癌的過程中，三者的敏感性和準確性上明顯高于尿脫落細胞學，有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），但在特異性上無顯著差異，三者之間的比較無顯著差異，無統(tǒng)計學意義。UBC、HA、Survivin在腫瘤的各分級和各分期、腫瘤單發(fā)／多發(fā)和初發(fā)／復發(fā)中的敏感性明顯高于尿脫落細胞學，且HA、Survivin在G3的敏感性高于G1，有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。在腫瘤多發(fā)的敏感性高于單發(fā)，在腫瘤的初發(fā)高于復發(fā)。近年來研究膀胱癌腫瘤標志物的報道持續(xù)上升，發(fā)現(xiàn)眾多膀胱腫瘤的分子標志，但大多數(shù)的作用機制尚不清楚，實驗表明尿中UBC、HA、Survivin聯(lián)合檢測敏感性高和特異較好，且優(yōu)于尿細胞學檢查。提示UBC、HA、Survivin聯(lián)合檢測可作為膀胱腫瘤的一種新的瘤標。

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