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13號染色體缺失與多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后相關(guān)性的研究

2012-10-09 03:56:28徐洪偉
中國實驗診斷學 2012年9期
關(guān)鍵詞:玻片漿細胞骨髓瘤

徐洪偉,賀 飛

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 檢驗科,黑龍江 哈爾濱150086)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是以漿細胞異常增生為特征的一種惡性腫瘤疾病,占血液系統(tǒng)腫瘤的10%、全身惡性腫瘤的1%[1]。好發(fā)于中老年人,近年來由于我國人口老齡化及人們對該病的認識水平提高,該病發(fā)病率有逐漸增加趨勢。染色體異常是MM預(yù)后的重要指標,而常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)操作繁瑣,周期長,干擾因素多,準確性和特異性欠佳,只有約3%的患者檢測結(jié)果為陽性,對治療反應(yīng)的判斷及微小殘留病灶的檢測較為困難。隨著熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)、比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)、光譜核型分析(spectral karyotyping,SKY)等細胞遺傳學和分子生物學技術(shù)的發(fā)展,MM細胞遺傳學研究領(lǐng)域有較大進展。本研究采用I-FISH 技術(shù),應(yīng)用D13S319特異性探針,探討 MM患者的細胞遺傳學異常與臨床特征的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 標本收集 2005-2009年我院確MM診病例64例,男44例,女20例,年齡34-85歲,中位年齡62歲;符合國內(nèi)MM的診斷標準[2],確診前均未接受過化療和其他特殊治療。I-FISH對照組選用同期10例非血液系統(tǒng)惡性疾病核型正常患者。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫固定電泳采用美國Helena公司全自動快速電泳分析系統(tǒng)(Rapid Eleetrophoresis,REP),重鏈IgG、IgA、IgM和輕鏈κ、λ進行免疫電泳后,與相應(yīng)抗體形成復(fù)合物被固定,然后進行染色、洗脫、掃描等。

1.2.2 免疫球蛋白定量采用美國 Beckman-Cou1ter IMMAGE免疫化學分析儀,以速率散射比濁法定量測定。

1.2.3 試劑 免疫固定電泳均用Helena公司生產(chǎn)的試劑盒。免疫球蛋白定量使用美國Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的試劑盒。

1.2.4 常規(guī)核型分析 取肝素抗凝骨髓,先行有核細胞計數(shù),以1×106-2×106/ml的密度注入10ml培養(yǎng)液,加有絲分裂原刺激劑PHA72小時,于終止培養(yǎng)前2-4小時加入秋水仙素終止中期分裂相后常規(guī)染色體標本制備。制備的染色體標本保存于-20℃,采用氣干法滴片,Giemsa液染色,在顯微鏡下觀察50個中期分裂相,核型描述依據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN1995)》。

1.2.5 間期熒光原位雜交(interphase fluorescence in situ hybridization,I-FISH)探針 檢測探針為針對13q14缺失的探針(D13S319),購自基因有限公司。(1)玻片制備:骨髓細胞懸液氣干法滴片,在室溫下過夜老化;將玻片在37℃新鮮配制的RNase A溶液中孵育30min,室溫放置30min;室溫下于2×SSC(pH7.0)溶液中漂洗玻片2次,依次置于室溫的70%、85%和100%乙醇中梯度脫水,自然干燥玻片。(2)變性雜交:玻片在74℃ 變性液(70%甲酰胺/2×SSC)中變性5min后在乙醇中梯度脫水,自然干燥;置于46℃烤片機上等待雜交;將10μl探針混合物(按照探針∶去離子水∶雜交緩沖液為2∶1∶7的比例混合)于74℃水浴中變性5min,46℃水浴10-15min后滴于玻片雜交區(qū)域,立即加蓋蓋玻片,用橡皮膠封邊;將玻片置于預(yù)熱的濕盒中,42℃溫箱中過夜雜交。(3)玻片洗滌:移去蓋玻片,置于65℃0.4×SSC/0.3%NP-40 洗滌液中洗滌 2 min,在室溫0.1%NP-40/2×SSC洗液洗滌1min,取出后暗處自然干燥,(4)熒光顯微鏡觀察:每份標本加10μl DAPI復(fù)染,用蓋玻片封好后置于暗盒中10-20min后,用熒光顯微鏡觀察間期細胞熒光雜交信號數(shù)目。每個探針計數(shù)200個細胞,用Isis-FISH圖像軟件采集圖像。

1.2.6 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測 采空腹靜脈血,分離取血清,應(yīng)用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動生物化學分析系統(tǒng),速率法340nm測定LDH活性,>250U為異常。

1.2.7 β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)檢測應(yīng)用Hitarchi全自動免疫分析系統(tǒng),免疫比濁法測定β2-MG含量。

1.2.8 白蛋白檢測(albumin,ALB)采靜脈血,分離心血清,應(yīng)用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動生物化學分析系統(tǒng),溴甲酚綠法測定。

1.2.9 血肌酐(Creatinine,CRE)檢測 采靜脈血,分離血清,應(yīng)用 BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自動生物化學分析系統(tǒng),苦味酸法測定。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件采用χ2、Fisher’s確切概率法檢驗分析MM患者中13號染色體缺失與13號染色體正常組之間 LDH、Creatinine、β2-MG、ALB的差異。應(yīng)用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線。用Cox回歸模型進行單因素及多因素分析,找出影響總體生存的預(yù)后因素。P<0.05視為有統(tǒng)計學意義

2 結(jié)果

2.1 64例MM患者一般資料 見表1。

表1 例64MM患者臨床特征

2.2 常規(guī)染色體核型分析及I-FISH檢測結(jié)果64例MM患者進行常規(guī)染色體核型8例(13%)未收獲淋巴細胞,56例獲得中期分裂相,其中13號染色體缺失28例(44%)(見表1)。傳統(tǒng)核型分析中8例異常,其中13q-2例(與I-FISH結(jié)果一致),亞二倍體2例,t(11;14)(q13;q32)1例,7q-2例,超二倍體1例。

2.3 13號染色體缺失與13號染色體正常組生存差異與相關(guān)因素分析 將13號染色體缺失與13號染色體正常兩組患者采用 Kaplan-Meier法評估生存曲線,13號染色體正常組患者生存時間長 (P=0.036)。將可能影響生存的因素如性別、年齡、白蛋白等進行Cox逐步回歸分析,結(jié)果顯示在排除β2-MG、Creatinine、白蛋白、血紅蛋白的影響條件下,13號染色體完整性是影響生存時間的獨立因素,13號染色體正常組患者生存時間長(見圖1)。在排除13號染色體的影響后,β2-MG對生存時間有影響,β2-MG值越高,生存時間越短,低β2-MG患者的死亡風險降低了59.82% (95%C I:0.14~0.59,P=0.041)。13號染色體缺失與13號染色體正常兩組患者在疾病進展方面存在顯著差異(P=0.042)。

圖1 13號染色體缺失與正常組患者生存曲線

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是惡性漿細胞病中最常見的一種類型,又稱骨髓瘤、漿細胞骨髓瘤,其病理機制尚未闡明,預(yù)后與 MM患者的血紅蛋白、肌酐、Ca2+和M蛋白、免疫分型及骨髓漿細胞數(shù)密切相關(guān)。

常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)由于骨髓漿細胞在體外的有絲分裂指數(shù)低下而受到限制,即使獲得足夠的中期分裂相,有些染色體異常仍然檢測不到,通常只有1/6左右的患者核型分析結(jié)果陽性。常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)可以檢測到的染色體異常通常為10-12Mb大小。I-FISH 技術(shù)通過檢測DNA探針與MM患者染色體異常所在靶區(qū)域的特異性結(jié)合(通常20-50Kb),對于染色體數(shù)目異常檢測的敏感性明顯優(yōu)于常規(guī)染色體G顯帶技術(shù)[3],且同時適用于分裂期和間期細胞,可以鑒別出很小的突變區(qū)域[4]。幾乎所有的 MM患者均存在染色體異常,且多為復(fù)雜核型異常,其中以涉及1、14號染色體結(jié)構(gòu)異常和13號染色體的全部或部分缺失最為常見[5,6]。13號染色體缺失在漿細胞疾病中較為普遍,且存在于 MM 的各個階段,未見于正常人[5]。不同研究結(jié)果顯示 MM患者中13號染色體缺失發(fā)生率約26%-50%[5,3,7]。13號染色體缺失的最小缺失區(qū)仍未精確定位。目前認為,染色體13缺失的致病主要經(jīng)由以下兩個途徑:(1)特定基因的單倍基因功能不全(例 GTF2F2,TSC-22和 RB1等);(2)細胞周期基因的擴增表達(例CCNB1,UBE2C等)[8,9]。其他與13號染色體缺失相關(guān)的分子水平改變還有:DNA修復(fù)缺陷、IGF1-IGF1R自分泌生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)路形成等,可能在發(fā)病過程中也具有重要作用[8]。對13號染色體缺失分子水平改變進行深入研究,將為MM患者提供新的治療靶點。

本研究顯示,64例初診 MM患者中28例(44%)13號染色體缺失,并且與β2-MG水平升高呈正相關(guān),提示細胞遺傳學異常與MM患者的腎功能衰竭等臨床特征有內(nèi)在聯(lián)系。13號染色體缺失組患者生存時間縮短,提示13號染色體缺失與MM的疾病進展、侵襲性病程、生存期縮短及預(yù)后關(guān)系密切。13號染色體缺失可以為MM的評估預(yù)后提供可靠依據(jù)。

綜上所述,13號染色體缺失在 MM的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要的作用,13號染色體缺失檢測可用于MM患者的臨床狀態(tài)、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷。

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