陳治中，卿吉琳，覃桂芳，胡麗華

（1．華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢430022；2．廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣西 南寧530021；3．廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 婦科，廣西 南寧530021）

最近一個(gè)新的T細(xì)胞表面受體家族－T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白 （T cell immunoglobulin mucin）家族已經(jīng)引起廣大研究者的興趣［1，2］。研究表明TIM家族與多種疾病如自身免疫病、哮喘等發(fā)病機(jī)制相關(guān)［2－4］。最新研究表明TIM基因家族可能是PS的一個(gè)新的受體家族，與PS結(jié)合介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的識別與清除［5］。人TIM家族蛋白屬于I型膜蛋白，由 TIM－1、TIM－3和 TIM－4組成。研究表明TIM－1優(yōu)先表達(dá)于人和鼠的Th2細(xì)胞表面，而TIM－3偏愛表達(dá)于人和鼠的Th1細(xì)胞表面，并且它們分別調(diào)節(jié)Th1與Th2細(xì)胞的免疫應(yīng)答，可能對維持體內(nèi)的Th1／Th2間的平衡起重要作用［2，6］。

通過對機(jī)體TIM－1和TIM－3mRNA表達(dá)水平的檢測，我們可以對機(jī)體內(nèi)Th1與Th2細(xì)胞狀況作一分析，從而對機(jī)體免疫系統(tǒng)的活化程度進(jìn)行初步評價(jià)。目前，檢測mRNA的方法有多種，由于實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real－time quantitative，fluorescence－based reverse transcription polymerase chain reaction，real－time RT－PCR）具有高度敏感性、準(zhǔn)確度高、動(dòng)態(tài)監(jiān)測和高通量等特點(diǎn)，已經(jīng)在科研和臨床中得到廣泛應(yīng)用，成為目前直接檢測機(jī) 體 mRNA 水 平 的 一 個(gè) 主 流 方 法［7，8］。SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈 DNA（dsDNA）非特異性結(jié)合［7］。與TaqMan探針比較具有設(shè)計(jì)簡單、低成本和能夠進(jìn)行熔點(diǎn)曲線分析檢驗(yàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性等優(yōu)點(diǎn)［7，9］。因此，本研究旨在建立人 TIM－1和 TIM－3 mRNA實(shí)時(shí) SYBR Green I定量 RT－PCR 檢測方法，為研究組織和細(xì)胞中的TIM－1和TIM－3mRNA的表達(dá)變化和它們在免疫調(diào)控中的作用提供一個(gè)技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1．1 引物設(shè)計(jì)和合成

應(yīng)用生物信息學(xué)知識，從Genbank中查閱出人TIM－1和TIM－3基因mRNA序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，并利用Primer5．0設(shè)計(jì)軟件，自行設(shè)計(jì)人TIM－1和TIM－3基因克隆引物和 mRNA擴(kuò)增引物，并由上海生物工程有限公司合成。

1．2 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的獲取及總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄

采用Ficoll法外周血單個(gè)核細(xì)胞。依據(jù)Trizol試劑（Invitrogen）說明書提取總mRNA。人TIM基因的cDNA文庫按照逆轉(zhuǎn)錄說明書（Takara）合成。

1．3 PCR擴(kuò)增及純化

用 TIM－1 基 因 的 克 隆 引 物，KTIM－1PF：5－CTAGCTAGCGCCACCATGCATCCTCAAGTGG TCATCT－3（含 Nhe I 位 點(diǎn) ）與 KTIM－1PR：5－GGGGTACCTTAGTCCGTGGCATAAAGACTA TTC－3（含 Kpn I位點(diǎn)）；用 TIM－3基因的克隆引物， KTIM－3PF： 5－CCGCTCGAGGCCACCATGTTTTCACATCTTCCCTTTGAC－3（含 Xho I位點(diǎn)）與 KTIM－3PR：5－GGGGTACCGTTGGCATTGCAAAGCGACA－3（含 Kpn I位點(diǎn)），按 Prime－STAR HS DNA 聚合酶（Takara）說明書分別擴(kuò)增人TIM－1和TIM－3全長片段，退火溫度為60℃。擴(kuò)增產(chǎn)物分別按。按DNA純化回收試劑盒（天根，中國）使用說明書純化PCR產(chǎn)物。然后分別按加A反應(yīng)試劑盒（Takara）說明書進(jìn)行加A反應(yīng)。

1．4 cDNA目的片段克隆

按照pMD18－T Simple載體說明書（Takara），連接上述人TIM－1和TIM－3加A的片段。并轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α（天根，中國），在含有 X－Gal、IPTG、Amp的L－瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，按藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑選幾個(gè)白色菌落，并用PCR菌液PCR證實(shí)。將PCR陽性菌液送上海生物工程有限公司測序證實(shí)。

1．5 重組質(zhì)粒濃度測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用質(zhì)粒提取試劑盒（天根，中國）提純質(zhì)粒，測定OD260／OD280分析純度，備用。根據(jù)重組質(zhì)粒提取物OD260nm吸光度，并通過如下公式計(jì)算純化產(chǎn)物原液的濃度。并按下面公式計(jì)算：

DNA 模板濃度（copies／μl）＝［A260×0．05×10－6g／μl×50 （稀釋倍數(shù)）／（660g／mol×堿基對數(shù)）］×6．02×1023。其中，1OD260＝0．05g／L 雙鏈DNA；1對堿基平均分子量＝660g／mol；TIM－1重組質(zhì)粒3 810bp，TIM－3重組質(zhì)粒3 620bp；6．02×1023為阿佛加德羅常數(shù)。

將備用的人TIM－1和TIM－3的質(zhì)粒制備成1010copies／μl數(shù)量級的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品原液，貯于－80℃。將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原液10倍梯度稀釋成1010－100copies／μl數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)品，取107－103copies／μl數(shù)量級的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行人 TIM－1和 TIM－3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，每個(gè)樣品3次重復(fù)，根據(jù)臨界循環(huán)數(shù)（Threshold cycle，Ct）以及模板起始拷貝數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)方程。

1．6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

在Lightcycler熒光PCR儀 （瑞士Roche公司）上擴(kuò)增并檢測熒光。用TIM－1基因的mRNA引物 MTIM－1FP：5－AACTGTCTCTACCTTTGTTCCTCC－3 與 MTIM－1FR：5－GTTCTCTCCTTATTGCTCCCTG－3，用 TIM－3基因的 mRNA 引物 MTIM－3FP：5－CAGATACTGGCTAAATGGGGAT－3 與 MTIM－3FR：5－ACCTTGGCTGGTTTGATGAC－3擴(kuò)增。Real－time PCR 反應(yīng)體系：10×PCR緩 沖 液 2μl，25mmol／L Mg2＋3．5μl，10 mmol／L dNTPs 0．4μl，10μmol／L引物各0．5μl，普通 Taq DNA 聚合酶 1U（1U／μl），質(zhì)粒 DNA 1 μl，BSA（1mg／ml）2μl，SYBR Green I（20×）1 μl，滅菌 H2O 8．1μl．空白對照管加1．0μl滅菌DEPC水代替質(zhì)粒DNA，蓋上蓋后瞬間離心，使樣品聚集在毛細(xì)管底部，然后上機(jī)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃2min，然后循環(huán)（94℃10sec；59℃（TIM－1）或者60℃（TIM－3）15sec；72℃15sec）40次，再分別進(jìn)行熒光檢測，并做熔解曲線對PCR產(chǎn)物的特異性進(jìn)行鑒定，最后反應(yīng)冷卻至40℃。

1．7 重復(fù)性與精密度的測定

將1．0×105copies／μl的標(biāo)準(zhǔn)品平行操作8次或在8d內(nèi)分別測定，獲取其批內(nèi)與批間變異系數(shù)（CV）。

2 結(jié)果

2．1 人TIM－1和TIM－3基因片段的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用特異性引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了與各自預(yù)期片段大小一致目的條帶。對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1）。重組質(zhì)粒DNA的測序結(jié)果表明，插入片段與原始片段的序列同源性為100%。

圖1 人TIM－1和TIM－3基因T載體雙酶切。1：TIM－3基因T載體XhoI／KpnI雙酶切；2：TIM－3基因T載體NheI／KpnI雙酶切；M：DNA Marker

2．2 人TIM－1和TIM－3Real－time RT－PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將含有目的基因片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋5個(gè)梯度（103－107拷貝／μl），進(jìn)行 Real－time RT－PCR 擴(kuò)增，獲得 TIM－1和 TIM－3的 Real－time RT－PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖顯示，起始模板濃度與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系；TIM－1和TIM－3標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析表明，相關(guān)系數(shù) （Coefficient of correlation，r）分別為1．00和1．00，直線回歸方程分別為：TIM－1，y＝－3．165x＋37．56，誤差（error）＝0．0724，Efficiency E：E＝10－1／slope－1＝1．070；TIM－3，y＝－3．268x＋37．55，誤差（error）＝0．0452，Efficiency E：E＝10－1／slope－1＝1．023。由此推測試驗(yàn)的過程和數(shù)據(jù)是非?？尚诺?，可用于待測樣本初始模板含量的測定。

2．3 人TIM－1和TIM－3Real－time RT－PCR熔解曲線的分析

熔解曲線分析確認(rèn)人TIM－1和TIM－3基因PCR產(chǎn)物的特異性。人TIM－1和TIM－3基因特異性產(chǎn)物都呈單一的熒光峰。峰值之前曲線平滑，未見其他明顯的非特異性熒光峰，可反映出擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性強(qiáng)。人TIM－1和TIM－3各自的熔解溫度（Tm）分別約為87℃和84．5℃。特異性產(chǎn)物經(jīng)過2．5%的凝膠電泳，證實(shí)擴(kuò)增特異性產(chǎn)物的片段大小與待擴(kuò)增的片段大小一致（圖2）。

圖2 人TIM－1和TIM－3基因檢測mRNA的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。1：人TIM－1的PCR產(chǎn)物；2：TIM－3的PCR產(chǎn)物；M：DNA Marker

2．4 重復(fù)性與精密度

SYBR GreenI實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測人TIM－1和TIM－3基因1．0×105copies／μl標(biāo)本的精密度。TIM－1基因批內(nèi)與批間的CV分別為1．55%和2．20%，TIM－3基因批內(nèi)與批間的CV分別為1．68%和2．01% （表1）

3 討論

目前研究表明新鑒定的TIM家族在免疫應(yīng)答和免疫耐受中起重要作用［10－12］。鼠類由8個(gè)成員組成（Tim1～8），位于鼠類染色體11B1．1上；人類由3個(gè)成員組成（TIM－1、TIM－3和TIM－4），位于人類染色體5q33．2上［2］。TIM基因編碼一類具有共同基序的跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括潛在的信號肽區(qū)、免疫球蛋白（IgV）樣區(qū)、黏蛋白樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)五部分［2］。TIM－1優(yōu)先表達(dá)于人和鼠的Th2細(xì)胞表面，作為一個(gè)潛在的共刺激分子調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，是一個(gè)哮喘和過敏癥等的易感基因［2，13，14］。TIM－3偏愛表達(dá)于Th1細(xì)胞表面，與其配體半乳凝素－9（galectin－9）結(jié)合產(chǎn)生抑制信號，負(fù)調(diào)節(jié) Th1免疫應(yīng)答［15－18］。TIM－4在抗原提呈細(xì)胞上高表達(dá)，與其配體TIM－1結(jié)合調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖［19－21］。TIM 基因晶體結(jié)構(gòu)顯示在其IgV區(qū)有一個(gè)特征性的FGCC＇結(jié)構(gòu)，可能是配體PS結(jié)合位點(diǎn)［22］。最新研究表明TIM基因家族可能是PS的一個(gè)新的受體家族，與PS結(jié)合介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的識別與清除［5］。因此，TIM基因參與調(diào)節(jié)Th1和Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答，與自身免疫病、哮喘和過敏癥等疾病發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

表1 人TIM－1和TIM－3基因標(biāo)準(zhǔn)品1．0×105copies／μl的批內(nèi)與批間精密度檢測結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR由于其具有高度敏感性和動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)勢而在科研和臨床中得到廣泛應(yīng)用［9，23］。主要應(yīng)用于定量分析各種基因的表達(dá)、基因分型和多態(tài)性分析、免疫組分分析、腫瘤研究和臨床疾病早期診斷與病原體檢測［24－26］。目前，實(shí)時(shí)熒光PCR的定量方法主要有為絕對定量和相對定量兩大類，各自具有優(yōu)缺點(diǎn)［25］。定量PCR需要實(shí)時(shí)檢測反應(yīng)中所形成的擴(kuò)增產(chǎn)物，而目前多采用與DNA非特異性結(jié)合的熒光染料或者標(biāo)記的序列特異性的探針來完成實(shí)時(shí)檢測［27］。與探針比較，熒光染料設(shè)計(jì)簡單、低成本、易操作和可以用熔解曲線分析特異性等優(yōu)點(diǎn)［25］。SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA（ds－DNA）非特異性結(jié)合［27］。在本研究中我們利用構(gòu)建的人TIM－1和TIM－3重組質(zhì)粒，成功建立人TIM－1和TIM－3mRNA 實(shí)時(shí)SYBR Green I絕對定量RT－PCR檢測方法。結(jié)果表明建立的人TIM－1和TIM－3Real－time RT－PCR定量技術(shù)具有很好的敏感性、特異性、線性范圍，為研究組織和細(xì)胞中的TIM－1和TIM－3mRNA的表達(dá)變化和了解它們在免疫調(diào)控中的作用機(jī)制進(jìn)一步奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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