文 / 蘭欣怡 張 彬 羅佳捷

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

熱應(yīng)激會(huì)引起細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)G1/S或G2/M的阻滯，劇烈的熱應(yīng)激還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。淋巴細(xì)胞凋亡率在冬季時(shí)最低，為0.44%，夏季高溫可顯著提高奶牛外周淋巴細(xì)胞的凋亡率，同時(shí)有研究數(shù)據(jù)顯示，淋巴細(xì)胞的凋亡率并不是在熱應(yīng)激初期就上升，而是有明顯的滯后效應(yīng)，即在熱應(yīng)激初期牛舍溫度為28.53 ℃時(shí)凋亡率上升不顯著，而牛舍溫度33.17 ℃時(shí)淋巴細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高，為17.79%（p<0.01），在熱應(yīng)激末期（27.03 ℃）淋巴細(xì)胞的凋亡率有所下降，為5.53%（p<0.01）[1]。

1 金屬硫蛋白與動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)激

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是重要的生理活性物質(zhì)，具有廣泛生物學(xué)功能，尤以清除自由基、抗應(yīng)激和調(diào)控細(xì)胞凋亡作用重要。MT是低分子量、富含半胱氨酸殘基并與金屬離子相結(jié)合的非酶蛋白質(zhì)。輻射、創(chuàng)傷、束縛等多種應(yīng)激因素均能誘導(dǎo)MT合成，肖定福等采用不同應(yīng)激因子對(duì)小鼠作用，誘導(dǎo)肝臟合成MT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷可在24 h內(nèi)使MT誘導(dǎo)合成量迅速增高，但24 h后MT誘導(dǎo)合成量從222.86%很快下降到68.29%（相對(duì)未創(chuàng)傷組）[2]。因此MT在小鼠體內(nèi)能快速解毒，同時(shí)有助于創(chuàng)傷愈合，提高細(xì)胞修復(fù)增殖速度。這可能與MT的抗氧化性能有關(guān)。張彬等采用125I標(biāo)記金屬硫蛋白（125I-MT），對(duì)MT在奶牛公犢體內(nèi)吸收、排泄、存留和分布等代謝規(guī)律進(jìn)行了研究，并證實(shí)MT對(duì)心肌、肝細(xì)胞等具有保護(hù)作用[3]。MT對(duì)重金屬的解毒作用和抗氧化作用已被廣泛接受，它在體內(nèi)分布廣泛，主要存在于胞質(zhì)和核內(nèi)，但其對(duì)細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。

天然條件下，MT中的巰基均以還原狀態(tài)存在，其中的金屬具有動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性，而巰基具有親核性，從而使MT易與親電性物質(zhì)特別是某些自由基相互作用，可作為高效抗氧化劑清除自由基，降低自由基對(duì)細(xì)胞的毒害，增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)能力[4，5]。MT的抗自由基作用是細(xì)胞保護(hù)的主要機(jī)制之一。損傷性刺激可誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)MT合成，給大鼠腹腔注射內(nèi)毒素后，肝臟MT含量比對(duì)照動(dòng)物增加62.6 倍，而脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)被明顯抑制。MT能清除OH自由基，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)。張彬等探討了外源性金屬硫蛋白對(duì)奶牛抗熱應(yīng)激的調(diào)控作用，Zn-MT可顯著提高奶牛血液中GSHPX和紅細(xì)胞中SOD的活性，提高抗氧化酶SOD基因的表達(dá)水平[6]；2009年又研究了MT針對(duì)奶牛的泌乳性能和抗氧化狀況，得出一系列成果[7]。據(jù)報(bào)道，MT清除OH自由基的能力是超氧化物歧化酶（SOD）的1 000 倍，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）的100倍，MT對(duì)OH自由基引起DNA降解的保護(hù)作用比還原型谷胱甘肽（GSH）強(qiáng)800 倍[8，9]，因而在細(xì)胞和組織中起保護(hù)DNA降解，使蛋白質(zhì)和脂類(lèi)物質(zhì)免遭氧化應(yīng)激損傷的重要作用。MT所具有的調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能主要是通過(guò)其抗氧化作用，提高ATP酶活性，保護(hù)線粒體的功能和抑制促凋亡蛋白的表達(dá)[10]，或通過(guò)影響B(tài)cl-2家族蛋白（又稱(chēng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白）的表達(dá)而抑制應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡[11，12]，或通過(guò)抑制線粒體Cytc的釋放及細(xì)胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活化，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的[13]。MT能調(diào)節(jié)NF-κB的活性。NF-κB是調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子、黏附分子、環(huán)氧合酶和NO合酶等基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在多數(shù)細(xì)胞中，NF-κB與它的抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)。TNF-α、IL-1和內(nèi)毒素脂多糖等通過(guò)磷酸化和降解IκB使NF-κB轉(zhuǎn)移入核，并激活靶基因轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)狀態(tài)和活性氧也參與NF-κB活性的調(diào)節(jié)。MT在胞質(zhì)可以抑制IκB的降解，從而阻止TNF誘導(dǎo)的NF-κB激活。MT還可能在核內(nèi)與Zn結(jié)合，經(jīng)調(diào)節(jié)鋅指結(jié)構(gòu)影響NF-κB與DNA的結(jié)合。作為NF-κB活性的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，MT能減少炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用[14]。

2 RIP3在細(xì)胞內(nèi)的定位

1995年，Stanger B Z等首次通過(guò)酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與Fas相互作用的蛋白，因而命名為受體相互作用蛋白（receptor-interacting proteins，RIPs）。RIP家族蛋白是一類(lèi)Ser/Thr蛋白激酶，與IRAK（interleukin-1-receptor-associated kinase）家族蛋白關(guān)系密切。它們不僅在結(jié)構(gòu)上都具有一段保守的激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD），而且在功能上很相似，許多細(xì)胞脅迫因子（如病原體感染、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、DNA降解等）都會(huì)引發(fā)細(xì)胞生存環(huán)境的改變，這些脅迫因子既有由細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的胞外信號(hào)，也有由細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變引發(fā)的胞內(nèi)信號(hào)，RIP家族成員就在這些刺激狀況下發(fā)揮重要作用。

RIP3過(guò)量表達(dá)能引發(fā)一種caspase依賴(lài)的細(xì)胞凋亡。該細(xì)胞凋亡的發(fā)生會(huì)依賴(lài)于IP3的C端，但不依賴(lài)于其激酶活性以及RIP3與RIP1相互作用的RHIM結(jié)構(gòu)域。過(guò)量表達(dá)RIP3，并用TNF處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)缺失了C末端的RIP3（只剩N末端氨基酸1-436）會(huì)抑制TNF誘導(dǎo)的caspase的激活，但不影響TNF誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路，這提示RIP3的C末端在TNF誘導(dǎo)的caspase依賴(lài)的細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮著重要的作用[15]。Yang Y等在Hela細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)RIP3，發(fā)現(xiàn)RIP3定位于胞質(zhì)，并且可以在細(xì)胞質(zhì)和核之間穿梭。他們同時(shí)在RIP3上定位出1 段非經(jīng)典的核定位和3 段富含亮氨酸的核輸出信號(hào)，分別為NLS（氨基酸442～472）、NES1（氨基酸255～264）、NES2（氨基酸344～354）、NES3Ⅰ（氨基酸116～126）和NES3Ⅱ（氨基酸121～131）[16]。其中NES1和NES2以CRM1依賴(lài)的方式介導(dǎo)RIP3出核，CRM1是一種主要的出核介導(dǎo)物，它與出核蛋白上的NES序列結(jié)合并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至核孔的出核部位；NES3則不需要CRM1的協(xié)助。NES1和NES2在鼠源RIP3內(nèi)的同源序列分別為氨基酸260～268和339～349[17]。Leptomycin B（LMB）是從鏈霉菌中分離出來(lái)的一種不飽和支鏈脂肪酸，其末端帶有內(nèi)酯環(huán)，它和CRM1的一個(gè)保守半胱氨酸巰基形成共價(jià)化合物，阻止CRM1和出核目標(biāo)蛋白的NES序列相互作用，是一種有效的CRM1介導(dǎo)的出核轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制劑。Hela細(xì)胞中外源表達(dá)的RIP3在LMB于37 ℃處理后，大多定位于細(xì)胞核內(nèi)，說(shuō)明RIP3是一個(gè)能夠在核質(zhì)間自由穿梭的蛋白質(zhì)，其主要的核輸出方式是CRM1依賴(lài)的，即通過(guò)NES1和NES2實(shí)現(xiàn)。RIP3上NLS（氨基酸442～472）的31 個(gè)氨基酸殘基正是外源表達(dá)RIP3誘導(dǎo)凋亡的最小序列，Yang Y等據(jù)此推斷RIP3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能可能與定位相關(guān)，在TNF刺激下，外源RIP3借助內(nèi)源RIP3共定位于TNF-R1信號(hào)復(fù)合體上，隨后磷酸化RIP1，調(diào)控NF-κB的活化[16]。

3 細(xì)胞凋亡與熱應(yīng)激反應(yīng)

細(xì)胞凋亡在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。當(dāng)暴露于各種理化及生物性刺激時(shí)，任何生物細(xì)胞（從細(xì)菌、酵母菌到高等動(dòng)物細(xì)胞）都將出現(xiàn)一系列適應(yīng)代償性反應(yīng)。這些反應(yīng)包括與損傷因素有關(guān)的特異性反應(yīng)和與損傷因素關(guān)系不大的非特異性反應(yīng)，統(tǒng)稱(chēng)為細(xì)胞應(yīng)激（cell stress）。在不同應(yīng)激原作用下，生物細(xì)胞都可出現(xiàn)某些類(lèi)似反應(yīng)，如多種生物、理化應(yīng)激原都可導(dǎo)致熱休克蛋白表達(dá)增加。過(guò)去不少學(xué)者傾向于將此視為“非特異性反應(yīng)”，但是，不同應(yīng)激原作用下熱休克蛋白表達(dá)的種類(lèi)和水平差別依然很大。

熱應(yīng)激反應(yīng)能促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡并減少活性氧釋放。細(xì)胞受到不良因素刺激時(shí)，均可通過(guò)基因表達(dá)模式的改變而導(dǎo)致一系列稱(chēng)為熱休克蛋白（HSPs）的合成，以維護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，并起著保護(hù)應(yīng)激結(jié)果的作用。HSPs是熱應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性產(chǎn)物，其中HSP70最為重要，分布在各種細(xì)胞中，并具有廣泛的保護(hù)作用。不同的組織細(xì)胞對(duì)同樣的熱休克具有不同的反應(yīng)。如在小鼠整體熱休克時(shí)（42 ℃，15 min，恢復(fù)24 h），心臟組織以誘導(dǎo)HSP70和HSP90α表達(dá)為主，而肝臟組織則以誘導(dǎo)HSP27/25為主。生物細(xì)胞暴露于高溫（熱休克）時(shí)所表現(xiàn)的以基因表達(dá)變化為特征的防御適應(yīng)反應(yīng)稱(chēng)為熱休克反應(yīng)（HSR）。許多研究表明，機(jī)體應(yīng)激時(shí)，應(yīng)激因素的刺激會(huì)引起細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和DNA損傷等多種反應(yīng)，其中細(xì)胞凋亡可最大限度地減少機(jī)體非生理性細(xì)胞壞死，以減輕大量細(xì)胞壞死所致的毒副作用。馮建江等研究表明，熱適應(yīng)處理明顯干擾熱應(yīng)激細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。夏季持續(xù)高溫容易對(duì)奶牛的生理機(jī)能造成影響，從而導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量的下降[18]。據(jù)報(bào)道，夏季熱應(yīng)激會(huì)造成奶牛外周血淋巴細(xì)胞的凋亡率顯著上升[1]。在熱應(yīng)激初期，動(dòng)物可通過(guò)自身調(diào)節(jié)來(lái)減弱熱應(yīng)激反應(yīng)，然而一旦超過(guò)自身調(diào)節(jié)的范圍，淋巴細(xì)胞凋亡率則大大升高。在高溫對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡試驗(yàn)中，凋亡率在處理后6 h達(dá)到高峰，而后逐漸降低，細(xì)胞凋亡率隨熱應(yīng)激程度的不同而不斷變化，也表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的滯后效應(yīng)。蔡亞非等曾在高溫對(duì)奶牛外周血淋巴細(xì)胞凋亡率影響的試驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡存在滯后效應(yīng)。此外，在熱應(yīng)激下，處于不同細(xì)胞周期淋巴細(xì)胞比例也會(huì)發(fā)生變化[19]。

[1] 李忠浩，孔麗娟，劉慶華，等. 不同溫濕指數(shù)下荷斯坦奶牛外周血抗氧化指標(biāo)的變化及其與淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，37（3）：280-285.

[2] 肖定福，張彬，李忠義，等. 不同應(yīng)激因子對(duì)小鼠肝臟金屬硫蛋白誘導(dǎo)合成的影響. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2009，17（2）：90-96.

[3] 張彬，肖定福，李麗立，等. 金屬硫蛋白在奶牛公犢體內(nèi)的代謝規(guī)律研究. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（6）：78-84.

[4] Romeroisart N，Vasak M. Advances in the structure and chemistry of metallothionein. J Inorg Biochem，2002（88）：388-396.

[5] Palmiter R D. The elusive function of metallothioneins. Proc Natl Acad Sci，1998（95）：8428-8433.

[6] 張彬，薛立群，李麗立，等. 外源金屬硫蛋白對(duì)奶?？篃釕?yīng)激調(diào)控及SOD基因表達(dá)的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（1）：193-198.

[7] Zhang B，Tan Q，Li L L，et al. Effects of exogenous metallothionein on GSH-Px & CAT gene expressions in Chinese Holstein dairy cattle. In：Proceedings of the 2nd International Symposium on Agricultural Research. Athens：2009，28-31.

[8] Abel J，Ruiter N. Inhibition of hydroxylradical-generated DNA degradation by metallothionein. Toxicol Lett，1999，47（2）：191-196.

[9] 張彬，譚瓊，劉海林，等. 金屬硫蛋白對(duì)奶?？寡趸窩AT和GSH-Px基因表達(dá)的影響. 中國(guó)科技論文在線，2009-04-07. http://www. paper.edu.cn.

[10] Shimoda R，Aehanzar W E，Qu W，et al.Metallothionein is a potential negative regulator of apoptosis. Toxicol Sci，2003（73）：294-300.

[11] Guo J B，Peng S Q. Protective effects of metallothionein induced by zinc against doxorubicin-caused alcytochromec release and caspase-3 cardiotoxicity and its potential mechanisms. Chin J New Drugs Clin Rem，2007，26（2）：81-86.

[12] 帥怡，郭雋，彭雙清，等. 金屬硫蛋白抑制阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡作用研究. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（4）：620-623.

[13] Wang G W，Klein K J. Metallothione in inhibits doxorubixin-induced mitochondriactivation in Cardiomyocytes Pharma.Exp Ther，2002，298（2）：461-468.

[14] 王迪潯，金惠銘. 人體病理生理學(xué). 北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：184.

[15] Duan W Z，Jing S，Juan L，et al. RIP3，an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from Apoptosis to Necrosis. Science，2009，325（17）：332-336.

[16] Yang Y，Ma J，Chem Y，et al.Nueleoeytoplasmic shuttling of receptor interacting protein3（Rip3）：identification of novel nudea export and import signals in Rip3. J Biol Chem，2004（269）：38820-38829.

[17] 張端午. RIP3作為細(xì)胞凋亡與細(xì)胞因子相互轉(zhuǎn)換的分子開(kāi)關(guān)的發(fā)現(xiàn)和機(jī)理研究：[博士學(xué)位論文]. 廈門(mén)：廈門(mén)大學(xué)，2009：40.

[18] 馮建江，劉兵，羅曉紅，等. 熱適應(yīng)通過(guò)P53依賴(lài)性細(xì)胞凋亡機(jī)制提高肝癌細(xì)胞熱耐受性. 西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2008，29（3）：216-218.

[19] 蔡亞非. 奶牛熱應(yīng)激的細(xì)胞免疫調(diào)控及其分子機(jī)理研究：[博士學(xué)位論文]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005：57-58.