林曉晨，楊 鑫，曹宇航，焦 麗，戴 甄，任林柱，逄大欣

(吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 動物胚胎工程吉林省重點實驗室，吉林 長春 130062)

CD4是一種跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于輔助T細(xì)胞表面，是TCR識別抗原的供受體，與MHCⅡ類分子多肽區(qū)結(jié)合[1]。目前已克隆鑒定了人、猴、鼠、兔、牛、貓、狗等動物的CD4-DNA序列。20世紀(jì)80年代，應(yīng)用單克隆抗體的免疫組織化學(xué)技術(shù)與流式細(xì)胞技術(shù)在豬的T淋巴細(xì)胞表面鑒定了CD4分子。CD4基因的表達(dá)受到多基因的控制[2]，其中包括啟動子、增強(qiáng)子及沉默子等調(diào)控元件[3]。為了能使CD4基因更好地表達(dá)，使其他物種啟動子為人類疾病研究起到輔助作用，CD4基因調(diào)控原件的研究一直成為研究重點。CD4分子以單體的形式存在，CD4+T 細(xì)胞能識別MHCⅠ類分子遞呈的抗原，它們除了作為細(xì)胞黏連分子發(fā)揮作用外,還是傳遞信號的分子,具有信號傳遞功能[4-5]?；蜣D(zhuǎn)錄是遺傳信息傳遞和表達(dá)的樞紐，是基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)[1]。而啟動子是決定轉(zhuǎn)錄起始點和轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元件，因此啟動子的識別對整個基因組功能的詮釋具有重要作用[6]。啟動子的研究對于闡釋基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制和基因組的功能都具有非常重要的意義。啟動子的結(jié)構(gòu)影響了其與RNA聚合酶的親和力，從而影響基因表達(dá)水平。轉(zhuǎn)錄單元(transcription unit) 是一段從啟動子開始至終止子(terminator)結(jié)束的DNA序列，RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點開始沿著模板前進(jìn)，直到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。在細(xì)胞中，一個轉(zhuǎn)錄單元可以是一個基因，也可以是幾個基因。啟動子區(qū)是RNA聚合酶的結(jié)合區(qū)，其結(jié)構(gòu)直接關(guān)系到轉(zhuǎn)錄的效率[7-8]。研究啟動子，也就是要研究其在細(xì)胞中啟動外源基因的能力，而對于較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來說，現(xiàn)在有—種新型的轉(zhuǎn)染方式——慢病毒侵染。慢病毒載體是HIV-1源性的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，采用表達(dá)VSV包膜蛋白取代了HIV本身包膜蛋白，使其大大提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并擴(kuò)展了感染宿主細(xì)胞的范圍，能感染所有組織來源的分裂和非分裂細(xì)胞，攜帶的目的基因能整合到宿主細(xì)胞基因組，使得外源基因獲得長期穩(wěn)定表達(dá)。目前，體內(nèi)外實驗中均未發(fā)現(xiàn)慢病毒載體對正常組織細(xì)胞有毒副作用。本實驗通過慢病毒表達(dá)載體研究異種基因啟動子在Jurkat細(xì)胞中調(diào)節(jié)外源基因表達(dá)的作用，該系統(tǒng)能在較長時間里明顯地觀察到外源基因的表達(dá)情況，本實驗旨在為建立人類白血病動物模型奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PGM-T載體購自Invitrogen公司；Tag酶 T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶購自 TAKARA公司；質(zhì)粒小抽試劑盒 膠回收試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒購自TIANGEN公司；NotⅠ 和EcoRⅠ 購自TAKARA公司；慢病毒包裝系統(tǒng)和293T包裝細(xì)胞購自Cell biolabs公司；Jurkat細(xì)胞由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室提供；RPMI 1640、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺、 非必需氨基酸、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶均購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒小抽試劑盒、膠回收試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒均購自 TIANGEN公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；引物由北京TIANGEN公司合成。

1.2 引物設(shè)計合成

根據(jù)查找的豬CD4基因序列進(jìn)行設(shè)計，SALMON等[8]已經(jīng)得出人和大鼠CD4基因啟動子具有相同的5對保守序列。首先查找豬CD4全序列，通過5對保守序列與豬CD4基因前1 400 bp比較，發(fā)現(xiàn)豬基因組中也同樣包含有與人、鼠相同的保守序列。另外，由于家豬與野豬在CD4基因啟動子與增強(qiáng)子序列上存在差別，所以通過啟動子在線分析軟件和從文獻(xiàn)中得到的序列，獲得家豬可能的啟動子與增強(qiáng)子范圍，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計引物，上游：5′-GCGGCCGCGATCTCCAGAGATCAAACC-3′;下游：5′-GAATTCAAGCGAGTCTCTGCAGAAGTA -3′,在上、下游引物加入NotⅠ和EcoRⅠ 2個酶切位點(下劃線部分)，并由北京TIANGEN公司合成。

1.3 基因的克隆及載體的構(gòu)建

提取長白豬的血液基因組作為PCR模板，利用6對引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為E*Tag0.5 μL，模板1 μL，引物各1 μL，DNTP 4 μL，Buffer 5 μL，ddH2O 37.5 μL，共50 μL。得到的產(chǎn)物回收并連接到PGM-T載體上進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與查找結(jié)果進(jìn)行比對，并與豬全基因組進(jìn)行比對，分析該片段是否正確。將慢病毒包裝系統(tǒng)主質(zhì)粒PSMPUW的啟動子EF-1α利用NotⅠ和EcoRⅠ 2個酶切位點切掉，連入已經(jīng)克隆得到的豬CD4基因啟動子，得到載體PSMPUW-SP，并比對確認(rèn)連入的片段是否出現(xiàn)偏差。用此載體進(jìn)行慢病毒包裝級檢驗實驗。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

Jurkat細(xì)胞株，于37℃ 、5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含有10%FBS、1%雙抗、1%谷氨酰胺替代物和1%非必須氨基酸的RPMI 1640培養(yǎng)基。Jurkat細(xì)胞為懸浮培養(yǎng)的癌細(xì)胞，生長速度很快，1～2 d就必須傳代1次。否則其培養(yǎng)基很難滿足其消耗致使細(xì)胞可能出現(xiàn)大量死亡或者生長狀態(tài)緩慢。293T細(xì)胞株，半懸浮半貼壁細(xì)胞，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基為包含有10%FBS,1%雙抗，1%谷氨酰胺替代物，1%非必須氨基酸的DMEM培養(yǎng)基。

1.5 慢病毒包裝、測定及侵染

1.5.1 慢病毒的包裝 提前1 d將293T細(xì)胞接種到6孔板，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合時進(jìn)行實驗。利用DPBS清洗選定的轉(zhuǎn)染孔2次，重新加入新鮮培養(yǎng)基待用。將慢病毒主質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒以3∶1∶1∶1比例與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，形成DNA與Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將Lipofectamine 2000-DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到準(zhǔn)備好的293T細(xì)胞中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6～8 h后換入帶有10%FBS的培養(yǎng)液。24和48 h后綠色熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞上清液，于4℃、4 000 r·min-1離心10 min，除去細(xì)胞碎片。以0.45 μm皿濾器過濾上清液于15 mL離心管中。放于-70℃保存待用。

1.5.2 慢病毒滴度的測定和侵染 在青霉素瓶或離心管中將保存的含有病毒的上清液作連續(xù)5倍的稀釋，從10-1到10-5。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，使細(xì)胞量達(dá)到(2～3)×105mL-1。設(shè)正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排(100 μL生長液+100 μL細(xì)胞懸液)。逐日觀察并記錄出現(xiàn)陽性結(jié)果的孔數(shù)，一般需要觀察5～7 d。根據(jù)下列公式計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。Reed-Muench兩氏法：距離比例=(高于50%的病變率的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%的病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%的病變率的百分?jǐn)?shù))；lgTCID50=距離比例×稀釋倍數(shù)之間的差+高于50%的病變率的稀釋對數(shù)。Karber法：lgTCID50=最高稀釋度的對數(shù)-稀釋度對數(shù)之間的差×(陽性孔比率總和-0.5)。

將Jurkat細(xì)胞計數(shù)，選取(1～2)×105的細(xì)胞換液后加入到24孔板中，20～24 h選取細(xì)胞最佳生長狀態(tài)時，將細(xì)胞培養(yǎng)液完全換成包涵病毒的培養(yǎng)液。左右輕搖細(xì)胞使細(xì)胞達(dá)到均勻分布為最佳，置于37℃ 、5% CO2條件下培養(yǎng)24～48 h后綠色熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 豬CD4啟動子的克隆及慢病毒載體的構(gòu)建

利用啟動子在線分析軟件查找前1 400 bp片段序列可能出現(xiàn)啟動子的位置，見圖1。由此設(shè)計引物，以血液提取出的基因組作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到豬CD4啟動子序列，并且將PCR產(chǎn)物連接T載體，得到PGM-T-SP，進(jìn)行測序并鑒定，鑒定結(jié)果見圖2。由于家豬與野豬基因不同，得到的結(jié)果與查找得到野豬的基因相似度在50%以上，得到的PCR產(chǎn)物包含5對保守序列。將得到的豬CD4基因啟動子片段利用NotⅠ和EcoRⅠ 2個酶切位點與利用2個酶切位點切掉啟動子的慢病毒主質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到PSMPUW-SP，將其轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)后經(jīng)KAN抗性篩選陽性質(zhì)粒，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果見圖3。慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果見圖4。

圖1 全基因前1 400 bp序列預(yù)測出的啟動子位置

圖2 SP的PCR結(jié)果(A) 和PGM-T-SP的鑒定結(jié)果(B)

圖3 PSMPUW-SP的酶切鑒定結(jié)果

2.2 慢病毒包裝結(jié)果

培養(yǎng)的293T細(xì)胞包裝病毒后，利用綠色熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，攜帶CD4基因啟動子的慢病毒包裝體系中的主質(zhì)粒進(jìn)入到293T細(xì)胞中，綠色熒光表達(dá)量很明顯。相對于EF-1α啟動子啟動的原質(zhì)粒,豬CD4基因啟動子在293T細(xì)胞中能更好地表達(dá)。CD4基因啟動子與EF-1α啟動子在293T細(xì)胞中的啟動效果沒有很大差別，說明豬CD4基因啟動子啟動的高效性。見圖5(封二)。

2.3 慢病毒滴度測定

結(jié)果顯示：病毒稀釋液濃度為10-1時出現(xiàn)8個陽性孔數(shù)，10-2時出現(xiàn)8個陽性孔數(shù)，10-3時出現(xiàn)6個陽性孔數(shù)，10-4時出現(xiàn)3個陽性孔數(shù)，10-5時出現(xiàn)0個陽性孔數(shù)；通過累加，病毒稀釋液濃度為10-1～10-5時分別出現(xiàn)25、17、11、3和0個陽性孔數(shù)。由此計算陽性孔數(shù)占總孔數(shù)的比例，10-1～10-5分別為100.0%、100.0%、84.6%、30.0%和0%。根據(jù)公式計算，Reed-Muench兩氏法：距離比例(84.6-50.0)/(84.6-30.0)=0.6，lgTCID50=0.6×(-1)+(-3)=-3.6,即TCID50=10-3.6·0.1 mL-1。Karber法：lgTCID50=-1-1×(3.125-0.5)=-3.625,同樣可以說明TCID50=10-3.6·0.1 mL-1。綜合2種計算結(jié)果得出大概的病毒量為10-3.6·0.1 mL-1。

圖4 慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

2.4 侵染結(jié)果照相

利用包裝出來的病毒侵染了2種細(xì)胞，侵染的293T細(xì)胞中可見成功包裝的慢病毒，見圖6(封二)。雖然包裝出來的病毒并沒有達(dá)到理想值，但其感染效果很明顯，綠色熒光表達(dá)很好，而且慢病毒表達(dá)時間較長的特性也能利于更好地觀測和得出結(jié)論。從侵染Jurkat細(xì)胞后對綠色熒光蛋白的觀察可見：CD4基因啟動子包裝出來的病毒與EF-1α啟動子包裝出來的病毒的陽性病毒相近，見圖7(封二)。結(jié)果顯示：克隆得到的豬CD4基因啟動子也許并非是一種特異性啟動子，其與人、大鼠CD4基因啟動子從遺傳特性上有著很大的不同。2種細(xì)胞侵染結(jié)果對比顯示：Jurkat細(xì)胞具有難轉(zhuǎn)染的特性，普通的轉(zhuǎn)染試劑很難達(dá)到效果。

3 討 論

豬作為一種模型生物有著很多優(yōu)點，并且越來越受到研究人員的關(guān)注，其生理特征和病理特征均可以作為研究的對象。本實驗對豬CD4基因啟動子進(jìn)行預(yù)測及克隆，并采用慢病毒表達(dá)載體對克隆得到的啟動子進(jìn)行驗證[9]。結(jié)果顯示其在293T細(xì)胞中可以大量表達(dá)，而且在Jurkat細(xì)胞中得到了同樣的結(jié)論。雖然人和大鼠的CD4基因啟動子在淋巴細(xì)胞中能夠特異表達(dá)，但研究發(fā)現(xiàn):豬CD4基因啟動子也許并非是一種特異性啟動子。目前，區(qū)別特異性啟動子與非特異性啟動子的方法，均是以基因在某種特定細(xì)胞中的表達(dá)量的多少來區(qū)分。以CMV啟動子為例，CMV啟動子來源于病毒,相對與內(nèi)源性的啟動子，在哺乳動物細(xì)胞中CMV啟動子表達(dá)可能更易于受到細(xì)胞內(nèi)沉默機(jī)制的影響[10]。CMV啟動子序列中含有NFκB 結(jié)合位點，NF 位點可以明顯增強(qiáng)CMV 啟動子啟動基因序列的表達(dá)水平[11]，然而CMV啟動子啟動外源基因表達(dá)并非是最好的選擇，真核基因的表達(dá)調(diào)控是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，在轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄延伸和轉(zhuǎn)錄終止的循環(huán)中，每一個細(xì)節(jié)都受到精細(xì)而復(fù)雜的調(diào)控?；騿幼釉谵D(zhuǎn)錄起始過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其能夠被很多反式作用因子識別，在不同細(xì)胞中，同一個啟動子因相互作用的反式作用因子不同,基因的表達(dá)水平也不同。而在同一細(xì)胞中，相同反式作用因子對不同啟動子的識別序列不一致。在某些細(xì)胞中這些組成型啟動子驅(qū)動的基因表達(dá)強(qiáng)度存在著差異。在小鼠胚胎干細(xì)胞中 CMV啟動子驅(qū)動基因的表達(dá)能力很弱,而伴隨著細(xì)胞的分化,CMV驅(qū)動基因的表達(dá)能力明顯增加。因此在目的細(xì)胞中篩選最適啟動子非常必要，轉(zhuǎn)錄起始的能力也并不相同。雖然在很多細(xì)胞中CMV啟動基因的表達(dá)效果最強(qiáng)，然而許多實驗[12-14]結(jié)果表明:CMV啟動子并不能在機(jī)體組織中長期持續(xù)表達(dá)。

如果說CMV并非特異性，那么是否也可以將在人癌細(xì)胞中同樣高表達(dá)的豬CD4基因啟動子作為非特異性啟動子?本實驗結(jié)果顯示:豬CD4基因啟動子和EF-1α啟動子啟動綠色熒光蛋白在細(xì)胞中表達(dá)量雖然有所不同，但總體趨勢不變。SP與EF-1α在相同細(xì)胞當(dāng)中有著同樣的表達(dá)效果。豬CD4基因啟動子與已經(jīng)確定的人、鼠CD4基因特異性啟動子有區(qū)別，空間結(jié)構(gòu)的不確定，反式作用因子的識別等都是制約啟動子在細(xì)胞中發(fā)揮作用的因素。實驗結(jié)果顯示真核細(xì)胞基因啟動子在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的空間結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄后修飾狀態(tài)是一定的，不同物種之間啟動子在細(xì)胞中的表觀遺傳學(xué)修飾狀態(tài)可能導(dǎo)致其驅(qū)動基因表達(dá)能力存在差異。本研究確定了豬CD4基因啟動子的序列和其在293T和Jurkat細(xì)胞中啟動綠色熒光蛋白基因的表達(dá)效果，在人類白血病癌細(xì)胞Jurkat中,CD4基因啟動子啟動效果與EF-1α啟動子啟動效果比較差別不大?？梢缘玫竭@樣的結(jié)論：豬CD4基因啟動子并非具有特異性。

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