劉金華，史艷宇，馬路遙，魏春艷，邵麗筠，王海龍

(1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長春 130062；2.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，吉林 長春 130022；3.吉林大學(xué)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教研室，吉林 長春 130021；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗公安局，內(nèi)蒙古 烏里雅斯太 026300；5.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，吉林 長春 130021)

近年來全球有關(guān)食品安全的惡性事件頻發(fā)，食源性致病菌成為威脅食品安全的主要元兇。其中金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、志賀氏菌、腸出血性大腸桿菌O157∶H7、空腸彎曲桿菌、副溶血弧菌、沙門氏菌(傷寒沙門菌、腸炎沙門菌)、產(chǎn)氣莢膜梭菌及變形桿菌等引起的食源性疾病居于世界前列[1]。傳統(tǒng)的致病菌檢測均采用生理生化、血清型水平的方法，試驗(yàn)周期長，耗時費(fèi)力，且靈敏度受限，因此有必要建立一種快速、簡便、靈敏度高的檢測手段[2-3]。多重PCR檢測方法因其能夠一次對多種致病菌同時檢測，而成為研究熱點(diǎn)[4-6]。本研究擬建立一種多重PCR檢測方法能夠同時檢測出單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、副溶血性弧菌及普通變形桿菌4種腸道致病菌，旨在為臨床疾病診斷、食品安全檢測、流行病學(xué)調(diào)控等工作提供良好的有效檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌種及其來源

副溶血性弧菌(Vibiroparahaemolyticus，ATCC17802)、普通變形桿菌(Proteusbacillusvulgaris，ATCC33420)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，ATCC11778)購于北京蘭博瑞公司。單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，ATCC19111)、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi，ATCC13311)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(分離株)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，ATCC13076)、志賀氏菌(Shigella)(分離株)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，ATCC33291)及大腸桿菌O157(EscherichiacoliO157) 保存于吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局微生物檢測實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑與儀器

DNA 提取試劑盒(Easy PureTMGenomic DNA Extraction Kit、PCR 試劑(TransStart Taq DNA Polymerase 及100 bp DNA Ladder Marker)均為北京全式金生物有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar，NA)培養(yǎng)基、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar，TSA) 血平板、溶菌肉湯(luria-bertani，LB) 液體培養(yǎng)基和革蘭陰性增菌液均為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司成品配制。

恒溫培養(yǎng)箱(德國Binder公司)、恒溫水浴箱(美國SHELLAB公司)，離心機(jī)3K30型(德國Sigma公司)、梯度PCR 儀ProS型(德國Eppendorf公司)、PowerPac Universal 164-5070 電泳儀(美國伯樂公司)、EC紫外成像系統(tǒng)(美國Alpha公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株培養(yǎng) 大腸桿菌O157、變形桿菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，然后挑取2～4個菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱經(jīng)過37℃培養(yǎng)24 h。單核細(xì)胞增生李斯特菌用TSA 血平板37℃過夜培養(yǎng)，取2～4個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。副溶血性弧菌用氯化鈉蔗糖平板37℃培養(yǎng)24 h，然后挑取2～4個菌落接種到氯化鈉結(jié)晶紫增菌液，37℃增菌8～16 h。

1.3.2 DNA 的提取 細(xì)菌DNA 的提取按照Easy PureTMGenomic DNA Extraction Kit使用說明中的操作規(guī)程進(jìn)行提取。

1.3.3 引物的設(shè)計和合成 根據(jù)GenBank中上述4種細(xì)菌的基因序列，通過序列比對，篩選出4種微生物的特異基因作為靶序列，并根據(jù)靶序列設(shè)計相應(yīng)的引物。引物的設(shè)計使用Primer express 2.0軟件進(jìn)行。使用 BLAST 程序，通過 GenBank，對各引物及擴(kuò)增產(chǎn)物同源性進(jìn)行比對，以保證引物與靶基因結(jié)合的高度特異性。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。序列見表1。

1.3.4 單重PCR擴(kuò)增 先對上述4種細(xì)菌進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增，反應(yīng)體系:模板DNA 1 μL(20 ng·L-1)，上、下游引物各1 μL(10 μmol·L-1)，10×TransStart Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL，TransStart Taq DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足 總體積至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性 30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，34個循環(huán)；72℃ 延伸10 min。

1.3.5 多重PCR擴(kuò)增體系的建立及退火溫度的優(yōu)化 多重PCR的反應(yīng)體系為50 μL 反應(yīng)體系，其中10×buffer 5 μL，Taq酶1.0 μL、dNTP 7.0 μL、Mg2+0.3 μL、上下游引物分別為1.0 μL時，模板：各加3 μL，ddH2O補(bǔ)足到50 μL。多重 PCR 擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。其中退火溫度分別為58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，根據(jù)電泳條帶的亮度確定出最佳退火溫度。

表1 多重PCR引物

1.3.6 多重PCR反應(yīng)的特異性和靈敏性檢測 多重PCR特異性檢測:分別提取志賀菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、普通變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌及大腸桿菌O157的基因組DNA，加入同一反應(yīng)體系，同時加入本研究中的4種細(xì)菌對應(yīng)的特異性引物進(jìn)行多重 PCR 擴(kuò)增，以檢測多重 PCR 的特異性。多重PCR靈敏性檢測：4種菌經(jīng)過37℃培養(yǎng)24 h后，取菌懸液依次10倍進(jìn)行梯度稀釋，然后按照1.3.2 的方法提取DNA，按照優(yōu)化后的多重PCR體系進(jìn)行反應(yīng)；同時，取稀釋后的各濃度菌懸液各1 mL，涂在LA平面培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計數(shù)。多重PCR反應(yīng)能夠檢出的最小DNA量所對應(yīng)的菌濃度即為該體系的靈敏度。

1.3.7 模擬果汁中細(xì)菌的檢測 購買市售的多種不同品牌果汁，取經(jīng)普通生化培養(yǎng)鑒定大腸桿菌O157、副溶血性弧菌、普通變形桿菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌均為陰性的果汁作為添加的樣品。取各稀釋的菌懸液隨機(jī)混合，加入到陰性果汁中混勻作為模擬樣本。過夜培養(yǎng)，取模擬樣本各1 mL離心后取沉淀物，按1.3.2試劑盒提取核酸，進(jìn)行多重PCR檢測。

2 結(jié) 果

2.1 單重PCR反應(yīng)的結(jié)果

對于變形桿菌ureR基因的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出大小約為522 bp 的特異性片段；用編碼單核細(xì)胞增生李斯特菌hlyA基因的引物進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增出大小約為 155 bp 的特異性片段；用編碼大腸桿菌O157的hlyA基因的引物進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增出大小約為 366 bp 的特異性片段；用編碼副溶血弧菌氨基酸脫氫酶基因引物進(jìn)行 PCR，擴(kuò)增出大小約為199 bp的特異性片段。

2.2 多重PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化

用梯度PCR儀依次設(shè)定退火溫度為58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示：64℃對應(yīng)的條帶最亮也最清晰，說明64℃為最佳退火溫度。見圖1。

圖1 多重PCR梯度退火溫度電泳圖

2.3 多重PCR特異性的檢測結(jié)果

同時在一個反應(yīng)體系中加入10種菌，然后加入本次研究的單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、變形桿菌和副溶血弧菌相應(yīng)的特異性引物。結(jié)果表明：只有該4種菌擴(kuò)增出特異性條帶，其他菌PCR結(jié)果均為陰性。

2.4 多重PCR靈敏度的檢測結(jié)果

對菌液進(jìn)行梯度稀釋，然后進(jìn)行多重PCR。結(jié)果顯示：第2條泳帶即稀釋成107倍時能夠清晰辨別出4條細(xì)菌的特異性條帶，所對應(yīng)的4種細(xì)菌的菌落計數(shù)數(shù)量級為103CFU·mL-1，即本研究中的4重PCR反應(yīng)體系的靈敏度。見圖2。

2.5 應(yīng)用該多重PCR體系檢測人工染菌果汁

對模擬果汁樣品的多重PCR檢測結(jié)果表明:該多重PCR體系可以成功擴(kuò)增出相應(yīng)的目的基因片段，從而識別出隨機(jī)接種的任意3種菌。見圖3。

圖2 多重PCR靈敏度的檢測結(jié)果

圖3 多重PCR檢測果汁中的細(xì)菌

3 討 論

多重PCR反應(yīng)是在同一個反應(yīng)體系中加入幾種目的基因的引物，通過一次反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對多種目的基因的同時擴(kuò)增[7]。由于在一個體系中不同的基因組之間、不同引物之間均會存在相互影響，所以必須對多重PCR體系進(jìn)行重新優(yōu)化，主要包括反應(yīng)中各組分的濃度[8-10]及退火溫度[8-11]。本實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計的方法快速、準(zhǔn)確地確定了最合適的各組分濃度，并對退火溫度進(jìn)行了摸索。本實(shí)驗(yàn)借助梯度PCR儀，一次性快速確定了最佳的退火溫度。此外PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性取決于引物和模板的匹配程度，本研究中一次性加入多種不同菌的引物，分別擴(kuò)增出相應(yīng)菌的基因片段，實(shí)現(xiàn)了一次PCR同時檢測不同病原菌的目的。本實(shí)驗(yàn)對靈敏度的檢測結(jié)果與徐曉可等[12]人的多重PCR靈敏度的檢測結(jié)果相近，高于李盛豐等[13]多重PCR靈敏度檢測結(jié)果?？赡苁怯捎谑褂迷噭┑臄U(kuò)增效果有差異；所選的菌種不同，彼此之間的抑制作用強(qiáng)弱亦不同；體系中各組分的比例、反應(yīng)循環(huán)數(shù)均對多重PCR的擴(kuò)增效果有影響。多重PCR與傳統(tǒng)的通過細(xì)菌培養(yǎng)鑒定菌的方法相比，具有快速、高效、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；與普通PCR相比具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，多重PCR可節(jié)省人力、物力，有助于提高病原菌的檢驗(yàn)效率。

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