黎 萍，張 捷，李亞榮，王 珂，蘇振中

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院血液腫瘤科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

肺癌中80%～85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，化療是NSCLC臨床治療的主要方法之一，以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，而肺癌內(nèi)在性或獲得性耐藥嚴(yán)重影響順鉑的臨床化療效果[1]。肺癌順鉑耐藥機(jī)制復(fù)雜，與P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Ⅱ等多藥耐藥因子表達(dá)呈正相關(guān)[2]；與血清p53抗體及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶陽性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[3]。近年研究[4-5]表明：DNA修復(fù)相關(guān)分子以及凋亡信號(hào)途徑的異常是肺癌順鉑耐藥的重要機(jī)制之一。Ku70是DNA結(jié)合蛋白，是DNA磷酸蛋白激酶的重要成分，參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，可獨(dú)立參與細(xì)胞DNA修復(fù)并具有抗凋亡作用[6]。研究[7]表明：Ku70的表達(dá)水平與頭頸部腫瘤放、化療后復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)，此外Ku70與甲狀腺癌[8]、宮頸癌[9]放療敏感性有關(guān)。本研究比較Ku70在人肺腺癌細(xì)胞系親代(A549)與人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞系(A549/DDP)的表達(dá)水平，觀察siRNA靶向沉默Ku70后A549/DDP細(xì)胞在順鉑作用下的增殖、凋亡情況，特別是耐藥性的變化，以期為肺癌順鉑耐藥提供潛在的分子標(biāo)志物，為臨床逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥、提高化療療效尋找有效的分子靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑人肺腺癌細(xì)胞系親代(A549)及其耐順鉑細(xì)胞系(A549/DDP)均購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸病研究所。dNTP、MMV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；Ex-Taq、DL-2000 DNA marker為Takara公司產(chǎn)品；MTT、順鉑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectin 2000及 Trizol為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品；胰酶、IMDM培養(yǎng)基為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；人Ku70抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自Santa-cruz公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒及Caspase-3 分光光度法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基公司。PAGE級(jí)引物由寶生物(大連)工程有限公司合成；siRNA序列由Ambion公司合成。Ku70siRNA序列為正義鏈5′-GAGUGAAGAUGAGUUGACATT-3′，反義鏈5′-UGUCAACUCAUCUUCACUCTG-3′；無意義的對(duì)照序列(Scramble)為：正義鏈5′-GGATTAAGTTCGGATAGT-3′，反義鏈5′-GCCTCTTAT-TCTCGACATCTA-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組A549及A549/DDP均在含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中于37℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化傳代。A549/DDP依次以半量(0.5 mg·L-1)、全量(1 mg·L-1)順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)各1周。實(shí)驗(yàn)分為空白組(A549/DDP細(xì)胞)、陰性對(duì)照組[轉(zhuǎn)染非特異性siRNA(si-Scramble)組]和實(shí)驗(yàn)組[轉(zhuǎn)染靶向Ku70基因的siRNA(si-Ku70)]。

1.3 A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞按5×105/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至70%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液更換為無血清的培養(yǎng)液。按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4～6 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。加藥組在轉(zhuǎn)染后48 h加6 mg·L-1順鉑。各組均在轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞。

1.4 RT-PCR檢測(cè)Ku70 mRNA的表達(dá)采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系中加入引物分別為：Ku70基因引物(產(chǎn)物為371 bp)，上游序列為5′-CTGTGCCAACCTCTTTAGTGATG-3′,下游序列為5′-TGGTTCATTTGTTTCCCGATA-3′；GAPDH基因引物(產(chǎn)物為500 bp)，上游序列為5′-GATTGTTGCCATCAACGACC-3′，下游序列為5′-GTGCAGGATGCATTGCTGAC-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s;94℃、30 s，54℃、30 s，72℃、30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各目的基因的相對(duì)密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算光密度(A)值的均值與標(biāo)準(zhǔn)差；以目的基因的相對(duì)A值間接表示基因的mRNA表達(dá)水平。

1.5 Western Blotting法檢測(cè)Ku70蛋白的表達(dá)分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，蛋白定量后，取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗人Ku70多克隆抗體雜交，再加入HRP-偶聯(lián)二抗，按ECL試劑盒說明書發(fā)光、曝光。以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算A值的均值與標(biāo)準(zhǔn)差。以目的蛋白的相對(duì)A值間接表示蛋白含量。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549/DDP細(xì)胞，以2×104/孔接種于96孔板。各組細(xì)胞加入50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5及0 mg·L-1濃度梯度的順鉑，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)24 h后行MTT法檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)570nm波長(zhǎng)的A值，計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值×100%。采用線性回歸計(jì)算順鉑對(duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.7 分光光度法檢測(cè)各組細(xì)胞的Caspase-3活性采用Caspase-3活性分光光度法檢測(cè)試劑盒，取50 μL 含100 μg 蛋白的細(xì)胞裂解上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入5 μL Caspase-3底物并于37℃ 避光孵育4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的A值。通過計(jì)算實(shí)驗(yàn)組的A值/陰性對(duì)照A值的倍數(shù)來確定Caspase-3活化程度。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率取1×106個(gè)細(xì)胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光反應(yīng)15 min；在1 h內(nèi)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析各組細(xì)胞的凋亡率。儀器參數(shù)為：激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)=488 mn，發(fā)射波長(zhǎng)(Em)=530 nm。

2 結(jié) 果

2.1 Ku70在A549/DDP細(xì)胞系與親代A549細(xì)胞系中的表達(dá)差異與親代A549細(xì)胞系Ku70 mRNA表達(dá)水平(0.752±0.028)比較，A549/DDP細(xì)胞系Ku70 mRNA表達(dá)水平(0.987±0.019)明顯增高(P<0.01)。見圖1A。與親代A549細(xì)胞系Ku70蛋白表達(dá)水平(1.042±0.058)比較，A549/DDP細(xì)胞系Ku70蛋白表達(dá)水平(1.287±0.031)明顯增高(P<0.01)。見圖1B。

圖1 Ku70在A549及A549/DDP細(xì)胞的mRNA(A)及蛋白(B)表達(dá)水平

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA后各組細(xì)胞Ku70的表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)組(si-Ku70)Ku70 mRNA表達(dá)水平(0.985±0.018)明顯高于空白對(duì)照組(0.885±0.076)及陰性對(duì)照組(0.385±0.058)(P<0.01)。見圖2A。以GAPDH做內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)組Ku70蛋白表達(dá)水平(0.389±0.011)低于空白對(duì)照組(1.256±0.078)與陰性對(duì)照組(1.291±0.047)(P<0.01)。見圖2B。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的生存率及IC50在不同濃度順鉑作用24 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生存率明顯低于陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組。見圖3。根據(jù)此結(jié)果，計(jì)算各組IC50值。實(shí)驗(yàn)組IC50為(8.73±0.62) mg·L-1，較空白對(duì)照組[(37.21±4.17) mg·L-1]和陰性對(duì)照組[(37.07±3.81) mg·L-1]顯著降低(P<0.01)。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后A549/DDP細(xì)胞中Ku70 mRNA(A)及蛋白(B)表達(dá)水平

2.4 細(xì)胞凋亡的變化6 mg·L-1順鉑作用24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率(23.16%±4.29%)高于陰性對(duì)照組(11.35%±2.68%)和空白對(duì)照組(9.56%±4.29%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。Caspase-3活性檢測(cè)表明：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Caspase-3活性高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖3 MTT法檢測(cè)順鉑作用后各組細(xì)胞生存率的變化

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)6 mg·L-1順鉑作用后各組細(xì)胞的凋亡率

表1 分光光度法檢測(cè)6 mg·L-1順鉑作用后各組細(xì)胞Caspase-3活性

3 討 論

肺癌順鉑耐藥機(jī)制復(fù)雜，目前的研究[2-5]已經(jīng)證實(shí)：DNA損傷修復(fù)、增殖與凋亡信號(hào)途徑相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白功能改變與肺癌順鉑耐藥密切相關(guān)。Ku蛋白是DNA重組修復(fù)系統(tǒng)中最重要的組成部分，在DNA雙鏈斷裂(double strand DNA breaks,DSBs)的同源重組和非同源末端結(jié)合修復(fù)途徑中發(fā)揮重要作用[10]。Ku70是Ku蛋白的組成成分之一,具有多種生物活性，參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，可獨(dú)立參與細(xì)胞抗凋亡，尤其是在DSBs的非同源末端結(jié)合修復(fù)途徑中發(fā)揮重要作用[6]。本研究表明：人肺腺癌細(xì)胞耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP Ku70 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于其親代非耐藥細(xì)胞系，提示Ku70的表達(dá)與肺癌耐藥直接相關(guān)；靶向?qū)隟u70 siRNA封閉A549/DDP細(xì)胞的Ku70基因，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果及文獻(xiàn)[11]方法，本研究采用6 mg·L-1順鉑作用于各組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生存率與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較明顯下降；實(shí)驗(yàn)組順鉑IC50明顯下降，提示靶向封閉Ku70可以逆轉(zhuǎn)耐藥的人肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性；Ku70 siRNA與順鉑有協(xié)同作用，有助于在靶向聯(lián)合治療中減少順鉑用量，有助于減少劑量相關(guān)副作用。本研究中凋亡檢測(cè)結(jié)果表明：在6 mg·L-1順鉑作用下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯增加、細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的凋亡執(zhí)行蛋白水解酶Caspase-3的活化程度明顯增加，提示靶向封閉Ku70能增加耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)肺腺癌順鉑耐藥。本文作者[12]曾對(duì)未封閉Ku70的A549/DDP細(xì)胞和靶向?qū)隟u70 siRNA封閉Ku70后的A549/DDP細(xì)胞進(jìn)行凋亡相關(guān)基因組的PCR Array檢測(cè)，結(jié)果表明：沉默Ku70后A549/DDP細(xì)胞促凋亡基因BAX、P53、P73的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，而抗凋亡基因TRAF、BFAR表達(dá)水平下調(diào)，提示靶向沉默Ku70逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥與促凋亡基因組的表達(dá)上調(diào)直接相關(guān)。有研究[13]表明：Ku70蛋白能與促凋亡蛋白BAX結(jié)合并抑制BAX介導(dǎo)的凋亡；且該過程獨(dú)立于其二聚體的Ku86。Gama等[14]研究表明：凋亡細(xì)胞的Ku蛋白表達(dá)水平下降；而對(duì)順鉑處理的宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞的研究[15]表明：靶向Ku70 siRNA下調(diào)Ku70表達(dá)，可抑制Hela細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，與本研究結(jié)果類似。Ku70可能通過加速DNA修復(fù)、抗凋亡增加人腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Ku70在人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞系中呈高表達(dá)狀態(tài)，靶向封閉Ku70可逆轉(zhuǎn)其肺腺癌耐藥，并推測(cè)Ku70可能通過調(diào)控凋亡基因的表達(dá)引起凋亡耐受，斷裂DNA修復(fù)加速，參與肺癌細(xì)胞耐藥的形成。本研究結(jié)果提示：Ku70可能成為臨床監(jiān)測(cè)腫瘤耐藥性變化的標(biāo)志物之一及逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥的一個(gè)新的分子靶點(diǎn)。

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