閆 振，李 衛(wèi)，吳 波

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院1.普外科;2.顯微外科，黑龍江 哈爾濱 150001

肝臟移植(liver transplantation，LT)目前已成為治療終末期肝病最有效的方法，然而同種異體排斥反應(yīng)仍然是器官移植的主要障礙，雖然全身應(yīng)用免疫抑制劑可以延長受體生存時間，但是可導(dǎo)致受體出現(xiàn)免疫功能低下，易發(fā)感染和腫瘤傾向［1］。鄭樹森等報道證實隨著移植技術(shù)和免疫抑制劑的應(yīng)用，LT患者的一年生存率有很大提高，為90%［2］，如何有效減少排斥反應(yīng)或抑制排斥反應(yīng)，是目前器官移植的研究熱點。轉(zhuǎn)化生長因子β1是有效地免疫調(diào)控和免疫抑制分子，它在機體免疫系統(tǒng)中的廣泛免疫抑制作用，對細胞免疫、體液免疫以及主要參與免疫反應(yīng)的一些細胞因子都有調(diào)控作用［3］。TGF-β1在心臟移植、腎臟移植、血管移植中有廣泛報道，但在肝臟移植中報道較少，本實驗利用輸注TGF-β1修飾的供者脾細胞研究TGF-β1質(zhì)粒與肝臟移植的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:供體為SD大鼠40只，受體Wistar大鼠40只，均為健康雄性，體質(zhì)量為250～300 g，SPF級，均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗過程對動物處置符合動物倫理學(xué)標準。

1.1.2 主要試劑:脂質(zhì)體2000試劑盒及Trizol試劑:美國Invitrogen公司;質(zhì)粒pAdtrack-CMV-TGF-β1質(zhì)粒和pAdEasy-1-Bj51833細胞株:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院傳染病實驗室曾令蘭教授惠贈;DP107-02高純度質(zhì)粒小量試劑盒:北京天根公司產(chǎn)品;RPMI 1640培養(yǎng)基及新生牛胎血清:奧地利PAA公司;臺盼藍染色試劑:上海碧云天產(chǎn)品;TUNEL檢測試劑盒:上海羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 TGF-β1 質(zhì)粒的制備:質(zhì)粒 pAdtrack-CMVTGF-β1質(zhì)粒和pAdEasy-1-Bj51833細胞株由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院傳染病實驗室曾令蘭教授惠贈。小量提取 DH5a細胞中的pAdtrack-CMVTGF-β1質(zhì)粒，Pme I線性化后，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下目的條帶，膠回收試劑盒回收連接產(chǎn)物的片段，取10 μL純化后的 DNA片段轉(zhuǎn)入感受態(tài)pAdEasy-1-Bj51833細胞中。鋪Kana+抗性瓊脂平板，培養(yǎng)16～20 h，挑取10～20個最小的克隆，用2 mL含0.025 g/L卡那霉素LB培養(yǎng)液振搖過夜，小量提取質(zhì)粒，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，以pAdEasy-1作參照條帶，與其大小相近的即為正確重組子。經(jīng)鑒定為pAdtrack-CMV-TGF-β1質(zhì)粒后大量擴增，分化提純后備用。使用時用無菌生理鹽水溶解。

1.2.2 TGF-β1基因修飾的脾細胞的制備:SD大鼠(6～8周)均在乙醚麻醉下無菌取脾，置于盛有不完全RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用200目篩網(wǎng)研磨和紅細胞裂解液處理后獲得單個的脾細胞，再用不完全RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，并用完全RPMI1640培養(yǎng)液(含10%體積/體積胎牛血清)調(diào)整終濃度至實驗所需(5×106/mL)，臺盼藍拒染法判定細胞活力＞95%，待用。培養(yǎng)的胞轉(zhuǎn)染前離心，置新鮮的RPMI 1640培養(yǎng)液中，使用脂質(zhì)體2000試劑盒按照說明書轉(zhuǎn)染脾細胞，轉(zhuǎn)染的脾細胞每3天換1次培養(yǎng)液，10～14 d后選擇建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染脾細胞株。

1.2.3 實驗分組與大鼠原位肝臟移植模型的建立:供體為SD大鼠，受體為Wistar大鼠，均為健康雄性，體質(zhì)量250～300 g，受體體質(zhì)量略大于供體，術(shù)前12 h禁食，清潔手術(shù)。實驗動物隨機分成4組，每組10只:A組:肝移植組，術(shù)前7天受體經(jīng)尾靜脈輸注生理鹽水1 mL;B組:空質(zhì)粒輸注組，術(shù)前7天受體經(jīng)尾靜脈輸注空質(zhì)粒1 mL;C組:脾細胞輸注組，術(shù)前7天受體經(jīng)尾靜脈輸注脾細胞(5×106/mL)1 mL;D組:TGF-β1組，術(shù)前7天受體經(jīng)尾靜脈輸注TGF-β1基因修飾的脾細胞(5×106/mL)1 mL。肝移植模型的建立采用Kamada二袖套法，并加以改進建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模型［4-5］。每組5只受體作為觀察生存期之用，觀察期以受體大鼠死亡為終點;另5只受體在移植后7天處死，觀察移植肝組織病理學(xué)改變，肝臟功能和凋亡的變化。各組因術(shù)中、術(shù)后發(fā)生感染、血栓形成、膽管梗阻等并發(fā)癥死亡的大鼠不列入統(tǒng)計之內(nèi)。

1.3 檢測指標

1.3.1 肝功能檢測:手術(shù)后第 3、5、7天，在麻醉狀態(tài)下，通過手術(shù)后大鼠的陰莖背靜脈采血0.5 mL(不抗凝)，化驗肝功能，檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清總膽紅素值(TBIL)。抽血后再輸入2 mL生理鹽水作為補液。

1.3.2 凋亡指數(shù):TUNEL檢測步驟TUNEL染色切片脫蠟至水，蛋白酶K消化15 min 4%多聚甲醛固10 min:3%H2O2，室溫封閉 10 min:0.1%TritonX-100 冰浴 2 min，每片加 50 μL，TUNEL 混合液，37 ℃ 1 h，每片加50 μL POD，37℃ 30 min，每步間 PBS洗3次。DAB顯色，水性封片劑液體封片，拍照。結(jié)果判定:應(yīng)用TUNEL法檢測，凋亡細胞胞核呈棕色，胞質(zhì)一般不著色或著色淡，高倍視野下陽性細胞的百分數(shù)(%)作為凋亡指數(shù)(AI)。

1.3.3 排斥反應(yīng)分析:手術(shù)后第7天，從各組隨機取5只受體鼠，予以麻醉，在麻醉情況下，取移植肝臟標本，以10%的甲醛固定，行HE染色后進行組織學(xué)觀察。根據(jù)Banff排異活動指數(shù)(RAI)評分體系分級，在光鏡下觀察急性排斥反應(yīng)的程度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，組間差異用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染脾細胞基因的表達 采用綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染到TGF-β1基因修飾的脾細胞中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的脾細胞同時表達TGF-β1蛋白和綠色熒光蛋白，熒光顯微鏡下可見穩(wěn)定表達的脾細胞都激發(fā)綠色熒光(見圖1)。

圖1 熒光顯微鏡下見篩選后的脾細胞都激發(fā)綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染后的脾細胞穩(wěn)定表達TGF-β1蛋白Fig 1 Fluorescence microscope，filtered spleen cells to stimulate green fluores-cence，indicating that the spleen cells after transfection and stable expression of TGF-β1 protein

2.2 肝移植后各組第3、5、7天血清 ALT及血清TBIL檢測 與肝移植組及空質(zhì)粒組相比TGF-β1修飾的脾細胞組肝臟功能較好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與脾細胞組相比，TGF-β1 修飾的脾細胞組改善肝功能較好(P ＜0.05)(見表1、表2)。

2.3 肝移植后各組凋亡指數(shù)(AI，%)TGF-β1組為39.2 ±5.11，脾細胞組 17.0 ±3.67，空質(zhì)粒組為 7.60±1.51，肝移植組為 4.40 ±2.07。TGF-β1 組與肝移植組及空質(zhì)粒組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，與脾細胞組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見圖2)。

2.4 各組病理學(xué)觀察 肝移植組及空質(zhì)粒組見排斥反應(yīng)較重，示匯管區(qū)增寬，大量淋巴細胞浸潤，并可見肝臟實質(zhì)的破壞;脾細胞輸注組，示肝細胞輕度淤血，中等量淋巴細胞浸潤;TGF-β1組移植排斥反應(yīng)較輕，匯管區(qū)形態(tài)規(guī)則，少量淋巴細胞浸潤，屬輕度排斥反應(yīng)(見圖3)。

2.5 肝移植術(shù)后各組存活時間 我們利用大鼠原位肝臟移植模型對TGF-β1修飾的脾細胞在大鼠肝臟移植免疫耐受中的作用進行研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1基因修飾組(36.4 ±4.16)d，生存期較肝移植組(8.4 ±1.4)d、空質(zhì)粒組(7.8±0.84)d明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);與脾細胞組(20.0 ±4.00)d 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 各組ALT結(jié)果(U/L，)Tab 1 ALT test results in each group(U/L，)

表1 各組ALT結(jié)果(U/L，)Tab 1 ALT test results in each group(U/L，)

與肝移植組和空質(zhì)粒輸注組相比，△P＜0.05;與脾細胞輸注組相比，※P＜0.05

組別 例數(shù)3 d 5 d 7 d肝移植組5319.28 ±17.35 561.16 ±60.35 917.25 ±54.39空質(zhì)粒輸注組 5 325.08 ±17.34 570.33 ±60.46 924.72 ±56.16脾細胞輸注組△ 5 287.62 ±21.06 216.07 ±30.50 201.62 ±33.28 TGF-β1 輸注組△※5256.99 ±9.12 172.00 ±16.52 113.23 ±20.35

表2 各組血清TBIL結(jié)果(μmol/L，)Tab 2 TBIL test results in each group(μmol/L，)

表2 各組血清TBIL結(jié)果(μmol/L，)Tab 2 TBIL test results in each group(μmol/L，)

與肝移植組和空質(zhì)粒組輸注相比，△P＜0.05;與脾細胞組輸注相比，※P＜0.05

3 d 5 d 7 d組別 例數(shù)

圖2 各組大鼠術(shù)后第7天Tunel凋亡圖中棕黃色顆粒為凋亡細胞(200×)A:肝移植組;B:空質(zhì)粒輸注組;C:脾細胞輸注組;D:TGF-β1修飾的脾細胞輸注組Fig 2 Tunel for liver tissues in each group at the end of 7th day，brown granules were apoptotic cells(Microscopy 200×)A:liver transplant group;B:empty vector infusion group;C:spleen cell infusion group;D:TGF-β1-modified spleen cell infusion group

圖3 各組大鼠術(shù)后第7天HE染色(100×) A:肝移植組;B:空質(zhì)粒輸注組;C:脾細胞輸注組;D:TGF-β1修飾的脾細胞輸注組Fig3 HE staining for liver tissues in each group at the end of 7th day(Microscopy 100×) A:liver transplant group;B:empty vector infusion group;C:spleen cell infusion group;D:TGF-β1-modified spleen cell infusion group

3 討論

自1963年Satzrl成功實行了第1例人體原位肝移植以來，肝臟移植已成為治療終末期肝臟疾病的重要手段。但是移植排斥反應(yīng)已成為阻礙其進一步發(fā)展的突出矛盾。基因技術(shù)有可能發(fā)揮其獨特作用，TGF-β1是一種重要的調(diào)節(jié)性細胞因子，對多種免疫活性細胞的增殖、分化、生物學(xué)功能起調(diào)節(jié)作用。人和鼠TGF-β1蛋白僅差一個氨基酸的不同［6］。TGF-β1具有強大的免疫抑制作用，是一種強效的免疫抑制性細胞因子，功能比環(huán)孢素還要強烈。TGF-β1抑制APC表面主要組織相容性復(fù)合物(MHCⅠ類、Ⅱ類分子)的表達［7］，干擾APC的分化成熟，使T細胞無能;TGF-β1還可以抑制NK 細胞，LAK 細胞的增殖和分化［8-9］。TGF-β1的諸多生物學(xué)功能和研究表明，在移植免疫中，移植的長期存活和移植物的耐受都與TGF-β1的生成和分泌有關(guān)。Qin等［10］將 TGF-β1基因轉(zhuǎn)移到心肌，監(jiān)測移植物的存活情況。TGF-β1可抑制多種免疫細胞如T細胞、B細胞、NK細胞和細胞毒性T細胞等。Asderakis等［11］報道通過注射供體來源的 TGFβl基因修飾脾細胞，顯著延長大鼠心臟移植的存活時間。Narumoto等［12］報道膽管細胞釋放的TGF-β1可以減輕同種異體抗原的免疫反應(yīng)等。

本實驗采用將構(gòu)建的 pAdtrack-CMV-TGF-β1質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脾細胞，獲得穩(wěn)定表達的TGF-β1基因修飾的脾細胞。TGF-β1轉(zhuǎn)染組生存時間較長，監(jiān)測術(shù)后第3、5、7天肝功能可發(fā)現(xiàn)基因修飾組肝臟功能在第5天時開始好轉(zhuǎn)，第7天逐漸恢復(fù)，而移植組肝臟功能隨著移植排斥反應(yīng)加重而逐漸升高。在移植排斥反應(yīng)過程中，發(fā)病過程主要是T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。TGF-β1在特異性免疫耐受中的作用主要通過對IL-2誘導(dǎo)的T細胞增殖活化發(fā)揮有效的負調(diào)節(jié)作用，影響T細胞生長因子受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達，抑制Rb蛋白磷酸化，誘導(dǎo)T細胞凋亡［13］。通過對肝臟細胞凋亡的檢測可證實TGF-β1基因修飾的脾細胞組凋亡較其他組明顯。有實驗證明TGF-β1可導(dǎo)致肝細胞的凋亡，在肝移植出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)時，隨著排斥反應(yīng)增加，其表達增高，凋亡細胞數(shù)增加［14-15］。本研究結(jié)果表明隨著TGF-β1基因的高表達，移植排斥反應(yīng)減輕，凋亡細胞數(shù)增加，受體生存天數(shù)延長。

通過我們的研究，認為TGF-β1是一種有效的免疫抑制因子，通過基因修飾的方法，可以提高受體的生存時間，減輕免疫排斥反應(yīng)，但其抑制免疫排斥的效果有限，具體的機制還需進一步研究，本實驗以大鼠為模型，為基因治療移植排斥反應(yīng)提供了一種新方法，但能否應(yīng)用于臨床及可操作性需要進一步研究。

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