河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院(石家莊050091)

張會(huì)珍 白亞平△ 肖紅玲 王鑫國(guó) 張 闖△△ 孫彥輝 吳中秋

血管性癡呆 (VD)是因腦血管因素所致的智能及認(rèn)知功能障礙臨床綜合征。近年來，隨著老齡人口不斷增加，VD發(fā)病率呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。VD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全探明，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏系統(tǒng)有效的治療手段，臨床對(duì)VD的防治多屬于對(duì)癥治療，［1］而中醫(yī)藥在防治腦血管病方面的優(yōu)勢(shì)已得到臨床驗(yàn)證。本研究通過復(fù)制腦缺血再灌注VD小鼠模型，觀察中藥復(fù)方聰智靈對(duì)VD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織乙酰膽堿酯酶 (AchE)活力的影響，探討聰智靈對(duì)VD的治療效應(yīng)及作用機(jī)制，為中醫(yī)臨床治療VD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性昆明小鼠100只，體質(zhì)量25 g～30 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 (昆明小鼠二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，合格證號(hào):612159)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 藥物:聰智靈由葛根、黃芪、當(dāng)歸尾、桃仁、紅花、地龍、石菖蒲等中藥組成，常規(guī)水提純法制成1 g生藥/mL，課題組自制，冰箱保存，備用。尼莫地平片由河北醫(yī)科大學(xué)制藥廠生產(chǎn) (批號(hào):H13022049)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配制成濃度為3 mg/mL的混懸液。

1.2.2 主要試劑:AchE試劑盒:南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào):20041115。

1.2.3 主要儀器:小鼠跳臺(tái)儀，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;HM-200型電子天平，日本OLYMPUS公司;MSE-25型高速冷凍離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;半自動(dòng)生化儀 (Humalyzer2000)，美國(guó)。

1.3 動(dòng)物分組和模型制備 將小鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、聰智靈高劑量組(簡(jiǎn)稱高劑量組)、聰智靈低劑量組 (簡(jiǎn)稱低劑量組)、尼莫地平組。參照文獻(xiàn)［1］制作腦缺血再灌注擬血管性癡呆動(dòng)物模型。將動(dòng)物用10%水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉，頸正中部常規(guī)消毒后切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套“4”號(hào)絲線扣，拉緊絲扣，阻斷血流20 min，同時(shí)在距尾尖1 cm處剪斷放血約0.3 mL，熱凝止血。松開絲扣使血液灌注10 min后，再次阻斷血流20 min，第2次再灌后觀察30 min，縫合皮膚。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎，尾部不放血，觀察時(shí)間與其他組相同。術(shù)后每日肌注青霉素0.2萬U，連續(xù)3 d。本實(shí)驗(yàn)維持動(dòng)物肛溫 (36±0.5)℃，防止低溫對(duì)缺血所致腦損傷的保護(hù)作用。

1.4 治療方法 術(shù)后當(dāng)天動(dòng)物蘇醒后開始治療。假手術(shù)組與模型組均灌服蒸餾水10 mL/kg體質(zhì)量，尼莫地平組灌服尼莫地平液30 mg/kg體質(zhì)量，低劑量組灌服聰智靈液29 g/kg體質(zhì)量 (相當(dāng)于臨床成人用藥量的10倍)，高劑量組灌服聰智靈液58 g/kg體質(zhì)量 (相當(dāng)于臨床成人用藥量的20倍)。各組均1次/d灌胃，連續(xù)治療15 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 行為學(xué)檢測(cè):于造模第15 d治療結(jié)束后進(jìn)行。采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)裝置是一10 cm×10 cm×5 cm的小鼠跳臺(tái)反應(yīng)箱，分為兩間，箱底為可通36 v連續(xù)電刺激的銅柵。每間右后角置一直徑和高均為4.5 cm的橡皮墊，作為小鼠回避電擊的安全區(qū)。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將小鼠置于跳臺(tái)儀中，適應(yīng)環(huán)境3 min，然后底部銅柵通以交流電，記錄動(dòng)物受到電刺激后跳上橡皮墊的反應(yīng)時(shí)間和5 min內(nèi)受電擊的次數(shù) (錯(cuò)誤次數(shù))，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后將小鼠置于跳臺(tái)儀中適應(yīng)3 min，再將其置于橡皮墊上，記錄第一次跳下橡皮墊的潛伏時(shí)間和5 min內(nèi)受電擊的次數(shù) (錯(cuò)誤次數(shù))，作為記憶成績(jī)。

1.5.2 海馬組織AchE活力檢測(cè):行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后在麻醉下斷頭處死小鼠，冰盤上快速剖取全腦，棄去嗅球及小腦。沿矢狀面方向?qū)⒛X組織對(duì)稱切開，取右側(cè)腦組織，分離海馬并稱重，按照重量和體積比1︰10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿，4℃ 4 000 r/min離心10 min，取上清液備測(cè)，采用分光光度法檢測(cè)AchE活力 (按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè))。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果 表1示，模型組小鼠的反應(yīng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，潛伏時(shí)間顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加，與假手術(shù)組比較差異有非常顯著性 (P＜0.01);各治療組與模型組比較，反應(yīng)時(shí)間縮短，潛伏時(shí)間延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，學(xué)習(xí)成績(jī)與記憶成績(jī)均優(yōu)于模型組，差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，其中，高劑量組學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均優(yōu)于低劑量組和尼莫地平組 (P＜0.05或P＜0.01)。

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(跳臺(tái)法)(±s，n=10)

表1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(跳臺(tái)法)(±s，n=10)

注:與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;與尼莫地平組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與低劑量組比較，△P＜0.05

組別 學(xué)習(xí)成績(jī)反應(yīng)時(shí)間 (s) 錯(cuò)誤次數(shù) (次)記憶成績(jī)潛伏時(shí)間 (s) 錯(cuò)誤次數(shù) (次)假手術(shù)組 21.24±8.48▲▲ 2.10±0.99▲▲ 247.99±51.77▲▲ 2.3±0.95▲▲模型組 63.08±14.68 7.80±2.78 81.10±36.72 7.90±2.81尼莫地平組 46.60±16.34▲▲ 5.20±2.39▲ 152.03±56.85▲▲ 5.20±2.30▲▲低劑量組 41.63±11.33▲▲ 4.80±2.66▲▲ 155.29±35.79▲▲ 5.50±2.60▲高劑量組 29.20±12.42▲▲＊＊△ 2.70±1.34▲▲＊△ 208.00±41.62▲▲＊△ 2.90±1.66▲▲＊△

2.2 AchE活性測(cè)定 表2示，模型組小鼠腦組織海馬區(qū)AchE活性較假手術(shù)組明顯下降 (P＜0.01)，各用藥組AchE活性均顯著高于模型組 (P＜0.01)，以聰智靈高劑量組優(yōu)于低劑量組和尼莫地平組 (P＜0.05)。

表2 各組小鼠海馬AchE活力比較(±s)

表2 各組小鼠海馬AchE活力比較(±s)

注:與模型組比較，▲▲P＜0.01;與尼莫地平組比較，*P＜0.05;與低劑量組比較，△P＜0.05

組別 n AchE(U/mgprot)假手術(shù)組 10 503.6±55.24▲▲模型組 10 346.86±52.56尼莫地平組 10 441.93±78.22▲▲低劑量組 10 436.04±62.63▲▲高劑量組 10 501.56±69.94▲▲＊△

3 討論

VD屬于中醫(yī)“呆病”、“善忘”、“文癡”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“腦為元神之府”，“腦為髓海”，髓海充實(shí)，則神清智明。VD患者多年老體弱，元?dú)獠蛔?，不能推?dòng)血液運(yùn)行，以致腦絡(luò)瘀阻，氣血不得濡養(yǎng)腦髓，以致神明失養(yǎng)，靈機(jī)記性失常，出現(xiàn)學(xué)習(xí)障礙，記憶衰退，反應(yīng)呆鈍等癥。正如《醫(yī)林改錯(cuò)》所云:“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀。”可見VD為本虛標(biāo)實(shí)之證，正氣不足為本，瘀阻腦絡(luò)為標(biāo)。課題組結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，篩選具有益氣活血、祛瘀通絡(luò)、醒神開竅的葛根、黃芪、當(dāng)歸尾、桃仁、紅花、地龍、石菖蒲等藥物組合成復(fù)方聰智靈。本方仿補(bǔ)陽還五湯重用生黃芪，以其大補(bǔ)元?dú)猓庠跉馔源傺?，祛瘀而不傷正，且氣味俱輕，具有升發(fā)之性，對(duì)腦氣不足、九竅不通者，黃芪實(shí)為上品;配以當(dāng)歸尾、桃仁、紅花等藥活血祛瘀;地龍通經(jīng)活絡(luò);石菖蒲醒神開竅，健腦益智;葛根升舉清陽之氣，有利元?dú)馍铣溆谀X，并有活血祛瘀之功(《本草拾遺》載“升者破血”)。諸藥合用，可使氣旺血行，瘀祛絡(luò)通，腦髓得養(yǎng)，靈機(jī)記性漸歸于常?，F(xiàn)代研究證實(shí)，益氣活血中藥可明顯改善VD模型的學(xué)習(xí)記憶功能，［3-5］具有顯著的抗VD作用;石菖蒲所含揮發(fā)油具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)癡呆模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能有顯著改善作用;［6-7］葛根素能促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞丟失，可明顯改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。［8］

海馬是學(xué)習(xí)記憶功能非常重要的腦區(qū)。研究證實(shí)，海馬直接參與了信息貯存和回憶，是缺血損傷最敏感的腦區(qū)。［9］近年來，在癡呆發(fā)病機(jī)理中，中樞膽堿能系統(tǒng)的作用逐漸被認(rèn)識(shí)，中樞膽堿能通路是學(xué)習(xí)記憶的主要通路，研究表明，VD的形成與中樞膽堿能系統(tǒng)的受損有關(guān)。乙酰膽堿 (acetyl-choline，Ach)為中樞膽堿能系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與學(xué)習(xí)、記憶等功能有密切聯(lián)系。Ach由膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 (ChAT)合成，被膽堿酯酶 (AchE)分解，通過Ach受體而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。如果ChAT和AchE的活性異常，將會(huì)引起Ach代謝失調(diào)，致使中樞膽堿能系統(tǒng)的生化改變。AchE作為Ach的水解酶，其活力變化可間接反映乙酰膽堿的含量和代謝情況。AchE是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵性酶，該酶降解Ach，當(dāng)AchE活力降低時(shí)，減弱了對(duì)乙酰膽堿的降解作用，致突觸間隙的乙酰膽堿濃度增高，使突觸后效應(yīng)增強(qiáng)，提高了谷氨酸神經(jīng)興奮毒性作用。［10］至于VD海馬區(qū)AchE活性下降的可能原因［11］是:由于腦組織缺血缺氧，使三羧酸循環(huán)障礙，提供酶生物合成時(shí)所需要的原料和能量減少;AchE分布于膽堿能神經(jīng)元上，缺血再灌注損傷了海馬的膽堿能神經(jīng)元，致突觸數(shù)量減少，ChAT活性降低，Ach生成減少，AchE的活性相應(yīng)下調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈缺血再灌注復(fù)制VD模型，行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組小鼠學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)均較假手術(shù)組顯著降低 (P＜0.01)，表明模型組學(xué)習(xí)和記憶能力障礙;益氣活血復(fù)方聰智靈與尼莫地平均可提高模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，表明聰智靈與尼莫地平均具有改善VD模型小鼠認(rèn)知障礙的作用，尤以聰智靈高劑量組作用明顯。AchE檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組海馬組織AchE活性顯著低于假手術(shù)組 (P＜0.01)，各用藥組AchE活性均顯著高于模型組 (P＜0.01)，提示腦缺血再灌注時(shí)膽堿能神經(jīng)元受損，AchE活性下降;中藥復(fù)方聰智靈能提高海馬區(qū)AchE活性，表明聰智靈減輕了缺血再灌注對(duì)海馬區(qū)膽堿能神經(jīng)元的損傷，且表現(xiàn)出量效關(guān)系。綜上，聰智靈改善VD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制，可能與減輕腦缺血再灌注對(duì)海馬神經(jīng)元損傷，提高海馬組織內(nèi)AchE活性有關(guān)。

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