儲(chǔ)菲菲，沐萬孟，邢慶超，周榴明，張 濤，江 波，*

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122;2.羅蓋特美國(guó)公司，基奧卡克52632，美國(guó))

Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及活性研究

儲(chǔ)菲菲1，沐萬孟1，邢慶超1，周榴明2，張 濤1，江 波1，*

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122;2.羅蓋特美國(guó)公司，基奧卡克52632，美國(guó))

D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶是生物法生產(chǎn)新型功能性因子D-阿洛酮糖最為有效的酶。一種新型的能夠編碼D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶的基因CLOBOL_00069被克隆，它來源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57為克隆載體，以pET-22b（+)為載體質(zhì)粒，E.coli BL21（DE3)為宿主細(xì)胞，構(gòu)建了基因重組工程菌。IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá);通過鎳柱親和層析，雜蛋白與目的蛋白得到了很好的分離。對(duì)純化的重組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，在約32ku處出現(xiàn)明顯的特征條帶。通過活性研究表明，Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase屬于DTEase家族，并具有較高的生物轉(zhuǎn)化率，反應(yīng)10h后轉(zhuǎn)化率達(dá)到20%。

D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶，D-阿洛酮糖，基因重組，親和層析

D-阿洛酮糖是一種在自然界中較為稀有的天然己酮糖，屬于稀有糖的一種，是D-果糖的差向異構(gòu)體。D-阿洛酮糖是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有特殊保健功能的新型功能性因子，它的熱量值只有0.007kcal/g[1];具有降低血糖的生理功能[2]和可抑制肝臟脂肪合成酶活性，減少脂肪沉積的作用[3];體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它具有神經(jīng)保護(hù)作用，可抑制6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的小鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[4];與D-葡萄糖和D-果糖相比，具有較強(qiáng)的清除活性氧的能力[5]。所以，由于其優(yōu)良的功能性質(zhì)而受到人們的廣泛關(guān)注，具有巨大的市場(chǎng)前景。D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶（D-tagatose 3-epimerase，DTE，EC5.3.1.-)家族則是實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖生物法生產(chǎn)的重要生物催化劑，可以催化D-果糖異構(gòu)化為D-阿洛酮糖。因此鑒于D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶的重要應(yīng)用價(jià)值，國(guó)內(nèi)外研究者已發(fā)現(xiàn)了幾種屬于DTEase家族的酶，如Pseudomonas cichorii DTEase[6-8]、AgrobacteriumtumefaciensDPEase[9-10]、Rhodobacter sphaeroidesSK011 DTEase[11-12]和Clostridium cellulolyticumDTEase[13]，它們異構(gòu)化果糖的效率分別為20%、32%、17%和30%。本文以Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTE基因組為模板，通過基因合成獲得DTEase的編碼基因CLOBOL_ 00069，以pET-22b（+)為載體，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pET22b-cb-dte，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物DTEase被鑒定具有生物活性，可以由D-果糖差向異構(gòu)化為D-阿洛酮糖，證明Clostridium bolteaeDTEase屬于DTEase家族，并具有較高的生物轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

載體E.coliDH5α、載體E.coliBL21（DE3)、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸、質(zhì)粒抽提試劑盒 均購自生工生物工程（上海)有限公司;表達(dá)載體pET-22b（+)、克隆載體pUC57 均購自上海閃晶分子生物技術(shù)有限公司;Wide Range DNA Marker（500～15000bp)、限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I、Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG)等 購于TaKaRa（寶生物工程有限公司，大連);低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 購于中科院上海生物化學(xué)研究所;Chelating Sepharaose Fast Flow 購自GE（烏普薩拉，瑞典);D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)品 購于Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase基因的克隆 上海閃晶分子生物技術(shù)有限公司通過基因合成技術(shù)合成目的基因CLOBOL_00069。同時(shí)，將Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)引入上下游引物5’端。然后再將其產(chǎn)物克隆入pUC57克隆載體上，以此得到重組質(zhì)粒pUC57-cb-dte。

1.2.2Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase基因的亞克隆 用Nde I、Xho I雙酶切表達(dá)載體pET-22b（+)和重組質(zhì)粒pUC57-cb-dte。而后，將回收到的目的片段與表達(dá)載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliDH5α，并涂布于LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)12h。LB固體培養(yǎng)基配比：胰蛋白胨1%（w/v)，酵母提取物0.5%（w/v)，氯化鈉1%（w/v)，瓊脂粉1.5%（w/v)。挑取白色菌落37℃培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.3Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase基因工程菌的構(gòu)建 通過1.2.2中的篩選與鑒定，獲得重組質(zhì)粒陽性克隆pET22b-cb-dte，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coliBL21（DE3)中，以此獲得基因工程重組菌E.coliBL21/pET22b-cb-dte。

1.2.4Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化 挑取基因工程菌E.coliBL21/pET22bcb-dte的單菌落，接種于小體積的含氨芐抗生素（終濃度50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，在200r/min，37℃條件下振蕩培養(yǎng)10h。接著，再按4%接種量將其接種至大體積的LB培養(yǎng)基中，同條件下振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體的OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入一定濃度的IPTG低溫誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。為了得到大量的目的蛋白，因此選擇了誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度等三個(gè)因素對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行初步的優(yōu)化。

1.2.4.1 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響 加入終濃度分別為0、0.1、0.5、1、1.5、2mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，固定其他條件：在200r/min振蕩條件下，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)時(shí)間5h。

1.2.4.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響 選擇不同的誘導(dǎo)時(shí)間0、1、2、3、4、5、6h，固定其他條件：在200r/min振蕩條件下，誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.5mmol/L，誘導(dǎo)溫度28℃。每隔1h取菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響 選擇不同的誘導(dǎo)溫度0、10、15、20、28、35℃，固定其他條件：在200r/min振蕩條件下，誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.5mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間5h。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE驗(yàn)證 取誘導(dǎo)后的菌液，加入SDS樣品緩沖液，混勻后煮沸幾分鐘，高速離心約1min，取20μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析（4%濃度的濃縮膠，12%濃度的分離膠)。

1.2.6Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的分離純化 低溫離心（8000×g，15min，4℃)收集菌體，然后以緩沖液（100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)重懸菌體，超聲波破碎大腸桿菌細(xì)胞5min（300W，開1s/關(guān)1s)后，低溫離心（10000×g，20min，4℃)棄細(xì)胞碎片，收集上清液進(jìn)行以下層析純化。

采用Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和層析柱（1.0cm×10.0cm)，對(duì)重組的Clostridium bolteaeDTEase進(jìn)行純化。上柱前預(yù)先用平衡液（100mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)平衡層析柱，蛋白酶液上柱后以洗滌液（平衡液+50mmol/L咪唑)洗脫雜蛋白，再用洗脫液（平衡液+500mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白，最后用透析液（50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5)對(duì)目的蛋白酶液進(jìn)行透析。以上操作均在4℃低溫條件下進(jìn)行。所得純化的重組蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。

1.2.7 Folin-酚法測(cè)定純化的重組蛋白濃度 取0.2mL純化過的酶液，加水補(bǔ)足至1.0mL，然后加5mL試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫20～25℃放置10min。再逐管加入0.5mL試劑乙（Folin-酚試劑)，同樣立即混勻，然后在室溫下放置30min，最后于650nm處測(cè)定管中溶液的吸光度值。蛋白濃度測(cè)定按《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》[13]設(shè)計(jì)操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出重組蛋白濃度。

1.2.8Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的酶活性鑒定 為鑒定該酶的生物活性，利用全細(xì)胞Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase和純化后的Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase進(jìn)行果糖轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。DTEase可催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，而D-果糖和D-阿洛酮糖含量可通過高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。HPLC條件：Waters Sugarpak-1鈣型陽離子交換柱，Agilent 1200高效液相色譜儀，Shodex示差折光檢測(cè)器。流動(dòng)相：純水;流速：0.4mL/min;柱溫：85℃;進(jìn)樣量：10μL。

1.2.9Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的催化效率研究 DTEase可催化D-果糖生成D-阿洛酮糖，將D-果糖（200mg/mL)，Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH7.0)和1U/mL的酶混合，45℃水浴，120r/min振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，每間隔1h取樣測(cè)定生成的D-阿洛酮糖的含量。底物D-果糖與產(chǎn)物D-阿洛酮糖含量可通過HPLC進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析

能夠編碼Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase的目的基因CLOBOL_00069通過基因合成獲得，將其克隆至pUC57載體質(zhì)粒中，再經(jīng)亞克隆將目的片段連接至表達(dá)載體質(zhì)粒pET-22b（+)中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliDH5α，挑取白色菌落37℃培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進(jìn)行鑒定（圖1)。

圖1 Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase質(zhì)粒抽提鑒定Fig.1 Plasmid extraction analysis of Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase

將獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-cb-dte經(jīng)Nde I、Xho I雙酶切和Nde I單酶切，酶切后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，pET22b-cb-dte限制性酶切鑒定結(jié)果見圖2。重組質(zhì)粒pET22b-cb-dte經(jīng)雙酶切后得到pET-22b（+)表達(dá)載體線性片段和插入的目的基因CLOBOL_00069，目的基因片段大小約為800bp，該片段與編碼Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase基因大小相同，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pET22b-cb-dte鑒定酶切圖Fig.2 Restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pET22b-cb-dte

通過NCBI Blast分析，目的基因編碼的氨基酸序列與之前報(bào)道過的DTEase家族Agrobacterium tumefaciensDPEase，Pseudomonas cichoriiDTEase，Rhodobacter sphaeroidesDTEase和ClostridiumcellulolyticumDTEase比較，有相對(duì)較高的氨基酸序列同源性，分別為49.48%、35.84%、29.10%和51.86%。

2.2 基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化

為了得到大量的目的蛋白，對(duì)重組菌E.coliBL21/ pET22b-cb-dte的誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行了初步的優(yōu)化，因此選擇了誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度等三個(gè)因素來進(jìn)行研究。

2.2.1 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)重組菌表達(dá)的影響 選擇加入不同終濃度的誘導(dǎo)劑IPTG，固定其他條件：在200r/min振蕩條件下，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)時(shí)間5h。從圖3可以看出，最適的IPTG終濃度為0.5mmol/L，IPTG的濃度過高將導(dǎo)致雜蛋白的過量表達(dá)，相應(yīng)的酶活將降低。

圖3 IPTG終濃度對(duì)重組菌表達(dá)的影響Fig.3 Effect of IPTG concentration on the expression of recombinant strains

2.2.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌表達(dá)的影響 在28℃溫度下，0.5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h可達(dá)到最高表達(dá)產(chǎn)物量（圖4)，5h以后，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)量不再增加。表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果所示，重組菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，約在32ku處明顯出現(xiàn)特征蛋白條帶。

圖4 重組質(zhì)粒pET22b-cb-dte在E.coli BL21（DE3)中的表達(dá)Fig.4 pET22b-cb-dte expression in E.coli BL21（DE3)

2.2.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌表達(dá)的影響 選擇不同的誘導(dǎo)溫度，固定其他條件：在200r/min振蕩條件下，誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.5mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間5h。從圖5可以發(fā)現(xiàn)，高溫誘導(dǎo)將導(dǎo)致酶活的迅速下降，所以為了防止目的蛋白DTEase形成大量包涵體，使用低溫誘導(dǎo)溫度。但是誘導(dǎo)溫度過低，也不利于目的蛋白大量表達(dá)，所以選擇的最適誘導(dǎo)溫度為20℃。

2.3 Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase的純化與蛋白含量測(cè)定

純化后的重組DTEase樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖6)，該重組DTEase的亞基分子量約為32ku，進(jìn)一步說明外源基因在宿主菌中得到了正確的表達(dá)。同時(shí)，目的蛋白經(jīng)鎳柱親和層析后得到單一的蛋白條帶，目的蛋白濃度達(dá)到90%以上，說明使用該方法可以很好地純化目的蛋白。

圖5 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌表達(dá)的影響Fig.5 Effect of induction temperature on the expression of recombinant strains

圖6 SDS-PAGE電泳分析純化后目的蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of the purified target protein

2.4 Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase的酶活性鑒定

利用純化后的Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase和全細(xì)胞Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase進(jìn)行果糖轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（圖7a和圖7b)，果糖與D-阿洛酮糖含量均可通過高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，圖中果糖與D-阿洛酮糖的標(biāo)樣保留時(shí)間分別約為14.6min和20.8min（圖7c和7d)。結(jié)果表明，Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase能夠催化果糖生成D-阿洛酮糖，純化后的酶活性更高，由此證明該酶屬于DTEase家族。

2.5 Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase的催化效率研究

反應(yīng)條件為45℃，pH7.0，在20%（w/v)的D-果糖反應(yīng)體系中，反應(yīng)10h產(chǎn)物含量達(dá)到最大，轉(zhuǎn)化率為20%（圖8)，10h后產(chǎn)量略有下降，這與產(chǎn)物的抑制作用有關(guān)。目前，國(guó)外已經(jīng)報(bào)道過的DTEase家族中的成員Agrobacterium tumefaciensDPEase[9-10]、Pseudomonas cichoriiDTEase[6-8]、Rhodobacter sphaeroidesDTEase[11-12]和Clostridium cellulolyticumDTEase[13]異構(gòu)化果糖的效率分別為32%、20%、17%和30%。

通過Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase催化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖，表明該新型酶具備工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的潛能。

3 結(jié)論

圖7ClostridiumbolteaeATCCBAA-613DTEase的生物活性鑒定Fig.7 Bioactivity analysis of Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase

本研究以Clostridium bolteaeATCC BAA-613的基因組DNA為模版，通過基因合成獲得DTEase的編碼基因CLOBOL_00069，將其成功轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌E.coliBL21（DE3)中獲得基因工程菌。在28℃溫度下，添加0.5mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)5h，表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到最大量。經(jīng)親和層析純化的蛋白酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，約在32ku處出現(xiàn)顯著的單一蛋白條帶，證明了Clostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase在大腸桿菌中得到了正確的表達(dá)。同時(shí)對(duì)Clostridium bolteaeDTEase的酶催化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在45℃條件下，全細(xì)胞反應(yīng)10h，D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為20%，說明在工業(yè)應(yīng)用上該新型酶具備生產(chǎn)D-阿洛酮糖的潛能。

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Study on expression，purification and enzyme activity of Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-tagatose 3-epimerase

CHU Fei-fei1，MU Wan-meng1，XING Qing-chao1，ZHOU Liu-ming2，ZHANG Tao1，JIANG Bo1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.Roquette America，Keokuk 52632，United States)

D-tagatose 3-epimerase is the most effective enzyme for the biological production of D-psicose from D-fructose，a novel functional factor.Gene CLOBOL_00069 encoding the D-tagatose 3-epimerase fromClostridium bolteaeATCC BAA-613 was cloned and expressed inEscherichia coli.E.coliBL21（DE3)were host cells with pUC57 as cloning vector and pET-22b（+)as plasmid to construct recombinant strains.The bacterium was induced by IPTG;then the recombinant DTEase was purified to electrophoretical homogeneity with affinity chromatography.The recombinant DTEase was analyzed by SDS-PAGE，and approximately 32ku exogenous protein was observed on the SDS-PAGE.The activity of recombinant DTEase was also studied，indicating thatClostridium bolteaeATCC BAA-613 DTEase belonged to DTEase family enzymes and had a high rate of biological transformation.The conversion reached 20%after 10h reaction.

D-tagatose 3-epimerase;D-psicose;gene recombinant;affinity chromatography

Q786

A

1002-0306（2012)07-0198-05

2011－06－20 *通訊聯(lián)系人

儲(chǔ)菲菲（1986-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（20906040);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（JUSRP31002);江蘇省社會(huì)發(fā)展科技支撐項(xiàng)目（BE2010626)。