向紹通 徐書雯* 李東風

(1.廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)神經(jīng)內(nèi)科廣東省醫(yī)學科學院廣東省老年醫(yī)學研究所廣東省神經(jīng)科學研究所，廣州 510080;2.廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心廣東省老年醫(yī)學研究所，廣州 510080)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見的老年異質(zhì)性腦神經(jīng)退行性疾病，以進行性記憶和認知功能喪失為主要臨床特征，是一種主要的老年癡呆癥，其病理特征以老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)為主。有文獻報道［1-2］，醫(yī)師如能在患者病理改變尚未達到不可逆階段時進行早期干預(yù)治療，可延緩或阻止病情發(fā)展，極大地減少AD對患者及社會的危害，故AD的早期診斷具有十分重要的意義。但到目前為止，還沒有獲得一個一致的、易重復(fù)的、敏感特異性均較高的理想生化標志物。β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的神經(jīng)毒作用是多種因素導(dǎo)致AD發(fā)病的共同通路，血清尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，可將無活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有蛋白水解酶活性的纖溶酶，后者可以降解聚集體或非聚集體形式的Aβ［3］，Alonso D F 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，血漿纖溶酶循環(huán)的異常與癡呆的嚴重程度相關(guān)，尚不知血清uPA濃度與AD的關(guān)系如何，是否可作為AD早期診斷的生物學標志。

1 資料和方法

1.1 研究對象與納入標準

納入標準與分型:①遲發(fā)型阿爾茨海默病(lateonset Alzheimer's disease，LOAD)患者:根據(jù)美國國立神經(jīng)病學、語言溝通障礙和卒中－老年性癡呆和相關(guān)疾病學會工作小組標準［5-6］中“很可能AD”的標準納入，簡易智能精神狀態(tài)量表評分:文盲≤17分、小學文化≤20分、初中以上文化≤24分，臨床癡呆評定量表≥1分，漢密頓抑郁量表評分＜7分，Hachinski缺血指數(shù)量表評分≤4分?；颊邽閺V東省人民醫(yī)院東病區(qū)2004年～2007年的門診及住院患者，均為漢族，遲發(fā)病例，相互間無血緣關(guān)系，共收集55例，男37例，女18例，年齡61～90歲，平均年齡(77.71±7.80)歲。根據(jù)臨床癡呆評定量表評分將患者分為輕度、中度和重度:1分為輕度，2分為中度，3分為重度。輕、中、重度癡呆例數(shù)分別為27、15、13例。②對照組:為廣東省人民醫(yī)院同期體檢人群中記憶及認知正常者，共61例，男43例，女18例，年齡66～86歲，平均年齡(75.63±5.10)歲，均為漢族，簡易智能精神狀態(tài)量表評分≥28分，漢密頓抑郁量表評分＜7;Hachinski缺血指數(shù)量表評分≤4分。年齡、性別均與LOAD組匹配。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

所有研究對象在獲得同意后，抽全血后制備成血清及提取白細胞后儲存于－70℃的冰箱。

1.2.2 血清uPA濃度測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測uPA濃度，試劑盒購自美國ASSAYPRO公司。血清樣本用EIA Diluent稀釋液按1∶2稀釋3倍;向微孔加入50 μL標準品或血清樣本，室溫孵育2 h;按說明書依次洗板后加入生物素酰化uPA抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶結(jié)合物、鉻精底物、中止液，最后用美國Bio-TEK公司的SvnergyTMHT多通道酶標儀于450 nm的波長讀取溶液的吸光度。所測濃度×3即為血清uPA濃度。

1.2.3 Plau基因P141L多態(tài)性基因分型［7］

所有入組病例均采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)進行plau基因P141L多態(tài)性基因分型，PCR引物:5'-CTGGTTGAGTCTTCCCTGAG-3'及5'-CTGCCACTTCTTCCTTCCCT-3'，引物由日本TaKaRa公司合成。擴增產(chǎn)物用AluⅠ限制性內(nèi)切酶進行酶切及電泳。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SASV8軟件進行統(tǒng)計學分析。對于病例組與對照組的年齡構(gòu)成和uPA濃度比較采用t檢驗，分層多組比較采用方差分析，對各組的性別構(gòu)成進行χ2一致性檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增及酶切產(chǎn)物的檢測結(jié)果

基因型可根據(jù)等位基因的片段來判斷:C/C型(野生型)為 729 bp;C/T 型為729 bp，594 bp，135 bp;T/T 型為 594 bp，135 bp，詳見圖1。

圖1 Plau基因P141L多態(tài)位點PCR-RFLP電泳圖譜Fig.1 PCR-RFLP electrophoregram of P141L polymorphic of plau gene

2.2 臨床一般資料比較

LOAD組及對照組性別及年齡構(gòu)成，差異均無統(tǒng)計學意義，性別比較:χ2=0.14，P=0.708 3;年齡比較:t=1.70，P=0.092 5，詳見表1。

表1 LOAD組和對照組性別及年齡的比較Tab.1 Comparison of gender and age between LOAD group and control group

2.3 各組血清uPA濃度的比較

將LOAD組進一步分成輕度及中－重度兩組，與對照組進行血清uPA濃度的比較，數(shù)據(jù)顯示，中－重度LOAD組血清uPA濃度較輕度LOAD組及對照組血清uPA濃度低，但差異無統(tǒng)計學意義(F=0.85，P=0.469 9)，詳見表2。

表2 LOAD組和對照組血清uPA濃度的比較Tab.2 Comparison of the concentration of uPA in serum between LOAD group and control group

2.4 Plau基因P141L多態(tài)性對血清uPA濃度的影響

將所有研究對象按基因型分為C/C、C/T、T/T 3組，3組血清uPA濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=4.89，P=0.009 2)，進一步進行兩兩比較分析，C/C組與C/T組差異無統(tǒng)計學意義;C/C組與T/T組以及C/T組與T/T組比較，差異均有統(tǒng)計學意義，結(jié)果表明，基因型C/C組及C/T組血清uPA濃度顯著高于T/T組，詳見表3。

表3 所有研究對象分C/C型、C/T型與T/T型3組血清uPA濃度的比較Tab.3 Comparison of the concentration of uPA in serum among the three genotypes from all subjects

3 討論

uPA是一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，uPA與其特異受體相結(jié)合，可將無活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有蛋白水解酶活性的纖溶酶。纖溶酶uPA與Aβ的降解密切相關(guān):Ledesma M D等［8］研究表明，纖溶酶可以增加人β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid protein precursor，APP)在α切割位點上的裂解過程，從而有效地降低Aβ的分泌。也有體外研究顯示［9］，uPA可以抑制Aβ微纖維的形成，減少Aβ的沉積，從而降低Aβ的毒力。Davis J等［10］報道，Aβ可以刺激體外培養(yǎng)的人腦血管平滑肌(human cerebro-vascular smooth muscle，HCSM)細胞中纖溶酶原激活因子的表達，利用核糖核酸酶保護測定和纖溶酶原酶譜分析法可以發(fā)現(xiàn)上述過程中纖溶酶原激活因子的表達主要是uPA，并伴隨uPAR表達的增加;在存在纖溶酶原的情況下，HCSM細胞中的Aβ被迅速降解，從而恢復(fù)細胞活力。因此可以認為，uPA表達的增加可以通過在局部降解或清除致病的Aβ來發(fā)揮對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用，uPA的異常與AD的病理生理有著密切的聯(lián)系。遺憾的是，本研究利用檢測了LOAD患者及正常對照組外周血清uPA的濃度，結(jié)果顯示LOAD組血清uPA的濃度和對照組差異無統(tǒng)計學意義，可以認為血清uPA濃度尚不能用來作為AD診斷的標志物。另外，本研究結(jié)果顯示，輕度LOAD患者血清uPA的濃度較中－重度患者高，雖然差異無統(tǒng)計學意義，但可以看出隨著AD患者病情的加重血清uPA的濃度呈遞減的趨勢。本課題研究人員分析此現(xiàn)象歸納原因有可能因為:①隨著AD患者病情的發(fā)展，老年斑從只有少許類淀粉樣纖維沉積的早期斑最后可以發(fā)展為中心有致密類淀粉核心的致密斑，隨著AD的病理進展，Aβ在腦組織及血管中的沉淀不斷增多。AD患者血漿 Aβ42濃度會隨之下降［11］。②Tucker H M 等［12］通過在體外細胞培養(yǎng)以及APP轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Aβ聚集體可以增加uPA的mRNA濃度。Davis J等［10］研究也顯示Aβ可以刺激體外培養(yǎng)的人腦血管平滑肌細胞中uPA的表達。綜上，隨著血清Aβ濃度的下降，理論上血清uPA的濃度亦會隨之下降。但近期有研究［13］結(jié)果顯示，AD患者顱內(nèi)的纖溶酶原激活因子的濃度并無改變，通過其抑制因子－1來降低纖溶酶原激活因子的活性。因此，盡管本研究顯示LOAD組血清uPA的濃度和對照組差異無統(tǒng)計學意義，接下來仍有必要對LOAD患者血清uPA的活性進行研究。

uPA是由位于10號染色體的長臂上的plau基因編碼，Ertekin-Taner N等［14］研究認為，位于 plau基因第6外顯子上的錯義C→T突變可使脯氨酸變?yōu)榱涟彼?P141L)，此突變可能是一個致病突變，可通過減少uPA的濃度，使Aβ42濃度的增加而發(fā)揮作用。本研究分析了plau基因P141L多態(tài)性對血清uPA濃度的影響，結(jié)果顯示C/T組及C/C組血清uPA濃度顯著高于T/T組，此結(jié)果與Ertekin-Taner N［14］的研究結(jié)果一致?？梢哉J為，plau基因第6外顯子上的錯義C→T突變可減少血清uPA的濃度，對探討AD的發(fā)病機制提供新思路。

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