陶昕晨，黃 和，*，李志清，高 平，廖建萌，黃國方，羅 林，陳 宏

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524025；

2.廣東省湛江市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測所，廣東湛江 524043)

水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的HPLC-UVD法測定

陶昕晨1，黃 和1，*，李志清2，高 平2，廖建萌2，黃國方2，羅 林2，陳 宏2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524025；

2.廣東省湛江市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測所，廣東湛江 524043)

建立同時(shí)檢測水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的HPLC－UVD法。以2%堿性乙酸乙酯作為提取溶劑，正己烷脫脂后直接經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行分析。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考在0.10～10.00mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。在添加濃度為0.25～5.00mg/kg時(shí)，平均回收率在81.00%～102.93%之間，RSD在1.95%～7.10%之間。氯霉素的檢出限為0.01mg/kg，甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限為0.02mg/kg。

高效液相色譜，氯霉素，甲砜霉素，氟苯尼考，水產(chǎn)品，殘留

氯霉素類（Chloramphenicols，簡稱CAPs）屬酰胺醇類（Amphemicols）廣譜抗生素。包括氯霉素及其衍生物，主要有氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphnicol，TAP）和氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）。氯霉素有很強(qiáng)的毒副作用，能夠?qū)е略偕系K性貧血癥，不可逆，且與使用劑量和頻率無關(guān)，美國、歐盟、日本等很多國家都禁止在動(dòng)物源性食品中檢出。中國在2002年也把它列為違禁藥物，禁止在動(dòng)物食品中檢出。甲砜霉素對血液系統(tǒng)的毒性比氯霉素小，但可以抑制人體免疫系統(tǒng)、紅細(xì)胞和血小板的生成，除中國和日本外，歐共體和美國均禁用于食品動(dòng)物。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定其在牛、豬和魚等可食用組織中最高殘留限量為50μg/kg[1]。氟苯尼考雖不會(huì)引起再生障礙性貧血癥，但對動(dòng)物胚胎有影響。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定其在可食性動(dòng)物組織中最高殘留限量為1000μg/kg[1]。氯霉素類藥物由于有良好的抗菌和藥理特性，特別是甲砜霉素和氟苯尼考不易產(chǎn)生耐藥性，與同類藥物之間不存在交叉耐藥性，很多對氯霉素產(chǎn)生耐藥性的菌株對這兩種藥物仍然敏感，現(xiàn)已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治的常用藥物。目前檢測氯霉素類藥物殘留的方法有氣相色譜法[2－6]及氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[7－8]、高效液相色譜法[9－11]及液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[12－14]、超高效液相色譜法[15]及超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[16－17]等。這些方法前處理比較復(fù)雜，耗時(shí)長，成本高。且甲砜霉素與氟苯尼考均為常用藥，樣品基體中可檢出的含量較高，而色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測這類化合物的檢測限一般在1μg/kg以下，在定量時(shí)常需進(jìn)行大比例稀釋。所以液相色譜法更適合于檢測。本研究采用2%堿性乙酸乙酯提取，正己烷脫脂，高效液相色譜－雙通道紫外檢測法同時(shí)測定水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，相關(guān)方法未見報(bào)道，該方法檢出限與報(bào)道的液相色譜紫外檢測法的檢出限相比要低，且峰型較好，抗干擾性強(qiáng)，可操作性強(qiáng)，回收率和精確度好，滿足甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩粝蘖康臋z測要求，同時(shí)也適合對氯霉素的殘留進(jìn)行檢測，因此可以在日常檢測中應(yīng)用。

圖1 氯霉素類藥物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of CAPs

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素（CSA號：56－75－7） 純度為99%；甲砜霉素（CSA號：15318－45－3） 純度為98.5%；氟苯尼考（CSA號：7321－34－2） 純度為99%；標(biāo)準(zhǔn)品 購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；HPLC級乙腈 購自德國Merck公司；乙酸乙酯、正己烷等 均為分析純；水為去離子水；對蝦、羅非魚 均由湛江國聯(lián)水產(chǎn)開發(fā)股份有限公司提供。

高效液相色譜儀（Waters Alliance2695/2489） 美國Waters公司；METTLER－TOLEDO XS－205電子分析天平 上海蘭易科學(xué)儀器有限公司；Sartorius arium－611VF超純水機(jī) 上海摩速科學(xué)器材有限公司；BP252組織搗碎機(jī) 北京中科科爾器材有限公司；XW－80A漩渦混勻器、HU3120B超聲波清洗器 上海比朗儀器有限公司；Sigma 3－18K高速冷凍離心機(jī) 北京博勱行儀器有限公司；美國N－EVAP111氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取0.010g（精確至0.0001g）氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈分別溶解定容到100mL棕色容量瓶中，配制成100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱保存，有效期3個(gè)月。使用時(shí)用流動(dòng)相逐級稀釋儲(chǔ)備液成一系列濃度的工作液。

1.3 樣品預(yù)處理

對蝦去頭、去殼、去附肢，取肌肉部分；羅非魚去鱗、去皮，取背部和腹部肌肉。用高速搗碎機(jī)將樣品搗碎后置于－18℃以下保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)將樣品自然解凍至室溫。

1.4 樣品提取與凈化

稱取2.0g（精確到0.01g）樣品于50mL離心管中，加10mL含2%的濃氨水、25%～28%乙酸乙酯，漩渦混勻1min，再加入5g的無水硫酸鈉，振蕩提取30min后，4000r/min離心10min，重復(fù)上述操作1次，合并上清液，50℃下氮吹近干，再加入2mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，漩渦混勻1min，加入5mL乙腈飽和的正己烷，漩渦混勻1min，4000r/min離心10min，棄去上層正己烷溶液，重復(fù)脫脂1次，取下層溶液過0.45μm的有機(jī)系濾膜上機(jī)測定。

1.5 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18反相色譜柱（250mm× 4.6mm i.d.，5μm）；流速：1mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：10μL；氯霉素檢測波長278nm，甲砜霉素和氟苯尼考檢測波長225nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將稀釋好的10μg/mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)液在波長190～370nm范圍進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)氯霉素在278nm、甲砜霉素和氟苯尼考在224nm處有最大吸收，故選擇氯霉素檢測波長為278nm，甲砜霉素和氟苯尼考檢測波長為224nm。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都屬于極性物質(zhì)，一般選用甲醇－水或乙腈－水作流動(dòng)相[18]。本實(shí)驗(yàn)比較了這兩種流動(dòng)相的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇－水作流動(dòng)相時(shí)，其保留時(shí)間比較短，容易被雜質(zhì)峰干擾。等度洗脫時(shí)，調(diào)高乙腈比例（30%～40%），甲砜霉素保留時(shí)間太短，容易受干擾；調(diào)低乙腈比例（15%～20%）時(shí)，雖然延長了保留時(shí)間，但其峰型都變寬，導(dǎo)致檢出限升高，所以選用梯度洗脫。經(jīng)過大量樣品測定，梯度洗脫時(shí)受到的干擾很少。結(jié)果如圖2所示。

圖2 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（10.00mg/L）Fig.2 Chromatogram of CAP，TAP and FF standard solution（10.00mg/L）

2.3 提取溶劑的選擇

常用丙酮、乙腈和乙酸乙酯等作為氯霉素類藥物的提取溶劑[18]。本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、2%堿性乙酸乙酯、乙酸乙酯－乙腈（1∶1）和2%堿性乙酸乙酯－乙腈（1∶1）對空白對蝦中3種氯霉素類藥物的提取效果，2%堿性乙酸乙酯和2%堿性乙酸乙酯－乙腈（1∶1）對3種氯霉素類藥物的提取效果相當(dāng)，但加入的乙腈使得在濃縮的過程中變慢，還增加了提取成本，所以選擇2%堿性乙酸乙酯作為最佳提取溶劑。通過大量實(shí)驗(yàn)樣品分析，該提取液對3種氯霉素類藥物的回收率較高，樣品液澄清，色譜的分離效果好。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)作圖，獲得氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表2。通過添加不斷稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品到空白樣品，前處理方法同1.4，以信噪比（S/N）為3作為檢出限，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限分別為：0.01、0.02、0.02mg/kg。

表2 回歸方程與相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 2 The regression equations，correlation coefficient，linear range and detection limits

2.5 方法回收率和精密度

在空白對蝦和羅非魚的肌肉樣品中，分別添加0.25、0.50、5.00mg/kg，3個(gè)濃度水平的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度水平做5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算這3種藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，三種藥物在0.25、0.50和5.00mg/kg添加水平下平均回收率在81.00%～102.93%之間，RSD在1.95%～7.10%之間。說明本方法可以滿足水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測要求。方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

圖3 對蝦空白樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of Shrimp blank sample

圖3表明，經(jīng)過前處理的空白對蝦樣品在目標(biāo)峰處沒有雜質(zhì)峰的干擾，且雜質(zhì)少，說明這種提取方法能夠有效的去除雜質(zhì)的干擾。

圖4 對蝦加標(biāo)樣品圖（5.00mg/kg）Fig.4 Chromatogram of Shrimp spiked sample（5.00mg/kg）

圖4表明三種氯霉素類藥物峰型和分離度較好，且無雜質(zhì)峰的干擾，說明選擇的檢測條件能夠很好的檢測對蝦中氯霉素類藥物的殘留。

圖5 羅非魚空白樣品圖Fig.5 Chromatogram of Tilapia blank sample

圖5表明此方法對空白羅非魚的提取與凈化使雜質(zhì)在2～4min被洗脫，能夠排除雜質(zhì)干擾，說明此方法能夠很好的去除羅非魚中雜質(zhì)對這三種氯霉素類藥物檢測的干擾。

圖6 羅非魚加標(biāo)樣品圖（5.00mg/kg）Fig.6 Chromatogram of Tilapia spiked sample（5.00mg/kg）

表3 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery and RSD of CAP，TAP and FF

圖6表明三種氯霉素類藥物峰型和分離度較好，且能夠有效去除雜質(zhì)干擾，說明這種方法能夠有效的提取和檢測羅非魚中氯霉素類藥物。

3 結(jié)論

建立了一種以梯度洗脫方式，雙波長同時(shí)檢測水產(chǎn)品中3種氯霉素類藥物殘留的HPLC－UVD法。以2%堿性乙酸乙酯為提取溶劑，超聲波提取，正己烷脫脂，帶紫外檢測器的高效液相色譜儀檢測。此方法前處理簡單、快捷，容易形成標(biāo)準(zhǔn)化操作，精密度高，重現(xiàn)性好，定性準(zhǔn)確，滿足甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩粝蘖康臋z測要求，同時(shí)也可以對氯霉素的殘留進(jìn)行檢測，適合于大量水產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留的快速檢測和監(jiān)控。

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Determination of residues of chloramphenicol，thiamphnicol and florfenicol in fishery products by HPLC-UVD

TAO Xin-chen1，HUANG He1，*，LI Zhi-qing2，GAO Ping2，LIAO Jian-meng2，HUANG Guo-fang2，LUO Lin2，CHEN Hong2
（1.Institute of Food Science and Technology of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China；
2.Zhanjiang Institute of Supervision＆Test on Quality＆Measure，Zhanjiang 524043，China）

A high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection method was developed for simultaneous determination of Chloramphenicol（CAP），Thiamphnicol（TAP）and Florfenicol（FF）in fishery products. Chloramphenicols（CAPs）residues were extracted by basic ethyl acetate，followed by sample cleanup with n-hexane and quantization by liquid chromatography with ultraviolet detector.Good linearities were obtained in the concentration ranging from 0.10～10.00mg/L for CAP，TAP and FF.The average recoveries and relative standard deviations（RSDs）for the analysis of all samples fortified over the range of 0.25～5.00mg/kg were in the range of 81.00%～102.93%and 1.95%～7.10%，respectively.The limits of detection were 0.01mg/kg for CAP and 0.02mg/kg for TAP and FF.

HPLC；chloramphenicol；thiamphnicol；florfenicol；fishery products；residue

ST207.5

A

1002－0306（2012）20－0080－04

2012－05－14 *通訊聯(lián)系人

陶昕晨（1988－），男，碩士研究生，主要從事食品質(zhì)量與安全方面的研究。

湛江市財(cái)政資金科技專項(xiàng)項(xiàng)目（2011D02）。