張 晨，許贛榮，嚴(yán)新龍

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；

2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122；

3.江蘇太倉海煙煙草薄片有限公司，江蘇蘇州 215400)

利用釀酒酵母改進(jìn)煙草萃取液的香氣特性

張 晨1，2，許贛榮1，*，嚴(yán)新龍3

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122；

2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122；

3.江蘇太倉海煙煙草薄片有限公司，江蘇蘇州 215400)

利用釀酒酵母對(duì)造紙法再造煙葉生產(chǎn)過程中的煙草萃取液進(jìn)行了轉(zhuǎn)化增香處理，應(yīng)用SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)處理前后煙草萃取液中的揮發(fā)性致香成分進(jìn)行了分析比較并且用處理前后的煙草萃取液分別涂布于煙草薄片片基上，并對(duì)這兩種片基進(jìn)行了評(píng)吸比較，結(jié)果表明，未處理的煙草萃取液中檢測出48種揮發(fā)性致香成分，而處理后的煙草萃取液中共檢測出83種揮發(fā)性致香物質(zhì)；經(jīng)過釀酒酵母處理后，酸類、酮類、酯類、烯烴類等致香物質(zhì)均有不同程度的增加，增香效果明顯，能夠改善煙草薄片的吸食品質(zhì)。

再造煙葉，煙草萃取液，釀酒酵母，致香成分

造紙法煙草薄片制備過程中利用煙草原料用水萃取、多效濃縮制備得到煙草萃取濃縮液[1-2]。而這種制造工藝在很大程度上只是原材料的物理性質(zhì)的改變，原料的固有化學(xué)性質(zhì)并未完全改變，燃吸時(shí)仍存在木質(zhì)氣較重、辛辣灼熱感較明顯、余味差等質(zhì)量缺陷。煙草中酸性香氣物質(zhì)能夠改善煙草酸堿度，賦予煙氣味和芳香特征，使煙氣柔和、適口[3]。中性香氣成分常用其含量多少來衡量煙葉香氣的強(qiáng)弱。煙草中主要的中性香氣物質(zhì)有β-大馬酮、3-庚酮、茄酮、新植二烯等。堿性香氣物質(zhì)包括煙堿、吡咯、呋喃等[4-6]。程昌合等[7]將煙草萃取濃縮液在45℃醇化處理數(shù)日，作者認(rèn)為經(jīng)過醇化處理后煙末濃縮液中的揮發(fā)性組分增多，且主要致香成分含量均有不同程度的增加。處理后煙草薄片的香氣量、諧調(diào)性、木質(zhì)雜氣和余味等方面有較明顯地改善。據(jù)此認(rèn)為，濃縮液醇化處理是提高煙草薄片吸食品質(zhì)和使用價(jià)值的有效途徑。但究竟是何種微生物在醇化過程中所起的作用包括有增加香氣成分的作用，論文并未給出明確的結(jié)論。我們認(rèn)為醇化過程中煙草萃取濃縮液濃度較高，微生物濃度較低，微生物的作用對(duì)萃取液的影響可能相對(duì)較弱。醇化作用很大程度上是由于溫度效應(yīng)所導(dǎo)致的濃縮液中各種物質(zhì)所發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。而且如此長時(shí)間的醇化處理，明顯增加設(shè)備投資。為了進(jìn)一步改善造紙法薄片的內(nèi)在品質(zhì)，對(duì)其中的煙草萃取液進(jìn)行發(fā)酵增香處理也是一種值得探索的工藝路線。酸類、醇類、羰基類、酯類等各種香味化合物，或者其前體物和中間產(chǎn)物，具有增加香氣的效果。這些物質(zhì)可通過微生物對(duì)煙葉或煙草萃取液的發(fā)酵轉(zhuǎn)化作用而產(chǎn)生。本文重點(diǎn)研究在煙草萃取濃縮液中外加釀酒酵母進(jìn)行快速轉(zhuǎn)化增香以提高萃取液中致香成分的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母 本實(shí)驗(yàn)室保存菌種；煙草萃取液 由太倉海煙煙草薄片有限公司提供；煙草萃取液 利用煙梗、煙梗粉末和碎煙葉按照一定的配料比，在65～75℃的溫度下兩相逆流萃取20min，自然過濾，再經(jīng)過兩效濃縮最終獲得（可溶性固形物含量約為40%）。

Agilent－1200型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；1200LGC/MS－MS氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國瓦里安公司；Carbomix H－NP色譜柱 美國賽分科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 煙草萃取液的轉(zhuǎn)化增香 量取400mL可溶性固形物含量為30%的煙草萃取液，進(jìn)行巴氏滅菌（70℃保持30min），置于懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)化增香實(shí)驗(yàn)裝置中，稱取6g釀酒酵母添加至煙草萃取液中，進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化溫度為30℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間為4h。細(xì)胞自然沉降后，倒出增香后發(fā)酵液體并收集沉降酵母菌體。

1.2.2 酵母干重的測定 取一定量的酵母濕菌體，利用水分測定儀測定其水分含量，計(jì)算酵母干重。

1.2.3 還原糖和可溶性總糖的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別量取0.5mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.0mL，置于具塞25mL試管中，吸取蒸餾水分別補(bǔ)充至2.0mL，再各加2.0mL DNS試劑。蓋上塞子，置于沸水浴中加熱6min，取出，用流動(dòng)冷水冷卻后用蒸餾水定容到刻度25mL，充分搖勻，靜置10min后，在紫外可見分光光度計(jì)上于540nm波長下，以空白（即量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL）為參比液，測其吸光度。經(jīng)回歸統(tǒng)計(jì)求出其回歸方程。

1.2.3.2 測定還原糖與總糖 還原糖待測液：取適量煙草萃取液于250mL容量瓶中定容，即為還原糖待測液。

水溶性總糖的提取。吸取還原糖待測液25mL于250mL三角瓶中，并加入1∶3（濃鹽酸與蒸餾水體積比）的鹽酸溶液7mL，置于沸水浴中酸化0.5h，加1～2滴甲基紅指示劑，用10%NaOH調(diào)至中性或偏堿性（pH7.0～7.5），轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶并定容，即為水溶性總糖待測液。

分別取還原糖待測液2.00mL，水溶性總糖待測液2.00mL，加入3，5－二硝基水楊酸顯色劑2.00mL，按標(biāo)準(zhǔn)液的處理方法測定吸光度，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的濃度并計(jì)算總糖含量。

1.2.4 SPME－GC－MS檢測方法 SPME分析條件：取10mL煙草萃取液，置于頂空瓶中，采用75μm CAR/ PDMS萃取頭，樣品預(yù)熱5min，50℃萃取30min。取出萃取頭，并立即插入GC/MS儀進(jìn)樣口（溫度250℃）中解吸7min，進(jìn)行GC/MS分析。

GC/MS分析條件：色譜柱：DB－Wax 30m×0.25mm× 0.25μm；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：初溫40℃，保持3min，以8℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持8min；載氣：He，流量1mL/min；進(jìn)樣量：1.0μL；El離子源溫度：200℃；電離能量：70eV；倍增器電壓：1000V；掃描范圍：33～450amu。

1.2.5 評(píng)吸方法 將處理前后的煙草萃取液涂布在煙草片基上，快速烘干，置于恒溫恒濕室中，維持煙草薄片濕度在12%左右，分別卷至成10支單料煙，由10人專業(yè)評(píng)吸組分別對(duì)香氣、雜氣、木質(zhì)氣、刺激性、灼燒感、余味和異味七個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)吸。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物轉(zhuǎn)化煙草萃取液基本工藝條件的確定

2.1.1 微生物菌種的選擇 本文選擇酵母菌，是因?yàn)榻湍妇前踩氖秤镁?，其次酵母菌有較強(qiáng)的產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)而增香的作用。先選擇了實(shí)驗(yàn)室保存的幾株酵母菌種進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)酵母菌也可以利用較高濃度煙草萃取液進(jìn)行生長。初步發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株釀酒酵母效果較好，容易產(chǎn)生多種酯類、酸類和酮類等致香成分，發(fā)酵后的萃取液含有酒香氣味且不易染菌。

2.1.2 釀酒酵母菌液態(tài)轉(zhuǎn)化煙草萃取液基本條件的確定

2.1.2.1 煙草萃取液可溶性固形物含量的確定 由于采用低可溶性固形物濃度的煙草萃取液進(jìn)行酵母菌的轉(zhuǎn)化發(fā)酵，之后需要利用高能耗的濃縮設(shè)備進(jìn)行萃取液濃縮，考慮生產(chǎn)成本問題，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)煙草萃取液濃度為30%和40%。釀酒酵母接入量為6g/L煙草萃取液，于150r/min、30℃搖床上恒溫培養(yǎng)24h，測定酵母菌體重量。

圖1 煙草萃取液可溶性固形物含量對(duì)釀酒酵母生長的影響Fig.1 Effect of tobacco extracts soluble solid content on saccharomyces cerevisiae growth

由圖1可知，煙草萃取液可溶性固形物含量過高，會(huì)抑制釀酒酵母的生長，煙草萃取液可溶性固形物含量為30%情況下，釀酒酵母的生長明顯要好于可溶性固形物含量為40%的情況。故釀酒酵母進(jìn)行煙草萃取液轉(zhuǎn)化發(fā)酵的最佳濃度選擇30%較為合適。

1.2.2.2 釀酒酵母添加量的確定 確定最佳煙草萃取液可溶性固形物含量之后，釀酒酵母接入量設(shè)定為6、15、30、45、60（干酵母菌g/L煙草萃取液），轉(zhuǎn)化發(fā)酵4h后，檢測轉(zhuǎn)化增香液糖類物質(zhì)含量。

由圖2能夠看出隨著酵母接入量的增加，煙草萃取液中還原糖和總糖逐漸降低，但是接入量大于15g/mL煙草萃取液時(shí)，糖類物質(zhì)含量下降趨勢呈現(xiàn)較緩趨勢，并且在接入量為15g/mL煙草萃取液時(shí)糖堿比（1.08∶1）也接近較適范圍（1.02∶1～1.05∶1）。

圖2 釀酒酵母接入量對(duì)糖類物質(zhì)變化影響Fig.2 Effect of saccharomyces cerevisiae inoculum size on the contents of saccharides

綜上所述，釀酒酵母接入量選擇15g/mL煙草萃取液較為合適。

1.2.2.3 釀酒酵母對(duì)煙草萃取液轉(zhuǎn)化時(shí)間的確定 確定最佳煙草萃取液可溶性固形物含量和釀酒酵母接入量之后，釀酒酵母轉(zhuǎn)化煙草萃取液的時(shí)間設(shè)為1、

2、3、4、5、6h，檢測轉(zhuǎn)化后煙草萃取液的糖類物質(zhì)含量。

圖3 釀酒酵母轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)煙草萃取液糖類物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of saccharomyces cerevisiae fermentation time on the contents of saccharides

由圖3可以看出，隨著釀酒酵母轉(zhuǎn)化時(shí)間的增加，煙草萃取液中還原糖和總糖含量逐漸下降，這可能是由于釀酒酵母利用轉(zhuǎn)化了糖類物質(zhì)。從圖3中看出，在釀酒酵母轉(zhuǎn)化時(shí)間在4h以上糖類物質(zhì)含量下降趨于平緩，可能是由于轉(zhuǎn)化時(shí)間過長，酵母生長處于平穩(wěn)期或者衰亡期。

綜上所述，綜合考慮產(chǎn)品運(yùn)轉(zhuǎn)周期和生產(chǎn)成本問題，釀酒酵母對(duì)煙草萃取液轉(zhuǎn)化時(shí)間選擇4h時(shí)較為合適。

2.2 煙草萃取液微生物發(fā)酵前后香氣成分的比較

在2.1節(jié)所述的最適條件下進(jìn)行釀酒酵母轉(zhuǎn)化增香煙草萃取液實(shí)驗(yàn)。利用頂空固相微萃取法（SPME）分別富集煙草萃取液和經(jīng)過釀酒酵母轉(zhuǎn)化增香的煙草萃取液中的揮發(fā)性成分，采用GC/MS法對(duì)萃取頭收集的氣體成分進(jìn)行分析，經(jīng)譜庫檢索，經(jīng)釀酒酵母轉(zhuǎn)化增香的煙草萃取液共鑒定出83種化學(xué)成分，而未處理的煙草萃取液只檢測出48種成分，分析結(jié)果見圖4、圖5所示。

2.2.1 酸類物質(zhì)含量比較分析 釀酒酵母處理后的煙草萃取液經(jīng)過GC/MS分析得出酸類物質(zhì)有9種，主要致香成分有6種，未處理的煙草萃取液中所含酸性有效致香成分僅有2種，而經(jīng)過處理的煙草萃取液酸類物質(zhì)致香成分增加至6種，較未處理的煙草萃取液主要增加了3－甲基丁酸（0.473%）、辛酸（0.498%）等酸類致香成分，如表1所示。

圖4 未處理煙草萃取液揮發(fā)性成分的氣相色譜－質(zhì)譜總離子圖Fig.4 GC－MS total ionic chromatogram of volatiles in untreated tobacco extract

圖5 釀酒酵母處理后煙草萃取液揮發(fā)性成分的氣相色譜－質(zhì)譜總離子圖Fig.5 GC－MS total ionic chromatogram of volatiles in tobacco extract

表1 處理前后煙草萃取液中酸類致香成分比較Table 1 The comparison of the acids between tobacco extract and control

2.2.2 酯類物質(zhì)含量比較分析 酯類致香物質(zhì)是主要的香味物質(zhì)，對(duì)煙草萃取液的氣味起到很重要的作用。經(jīng)過GC/MS分析得出處理后的煙草萃取液含酯類物質(zhì)有10種，如表2所示。未處理的煙草萃取液中主要的酯類致香成分只有乙酸乙酯和丁內(nèi)酯，含量分別只有4.108%和1.705%，而經(jīng)過釀酒酵母處理后的煙草萃取液酯類物質(zhì)種類增加至10種，總量達(dá)14.199%。經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后的煙草萃取液中主要增加了乙酸乙酯（8.853%）、辛酸乙酯（2.343%）、癸酸乙酯（1.097%）等酯類成分。

2.2.3 醇類物質(zhì)含量比較分析 醇類物質(zhì)是煙草萃取液中重要的揮發(fā)性物質(zhì)。處理后煙草萃取液經(jīng)過GC/MS分析得出醇類致香物質(zhì)有16種，如表3所示。未處理的煙草萃取液醇類致香物質(zhì)種類有9種，總量達(dá)11.492%，而釀酒酵母處理后的煙草萃取液醇類致香物質(zhì)種類有16種，總量達(dá)52.712%，較未處理的煙草萃取液，增加的主要醇類致香物質(zhì)有乙醇（24.021%）、異丁醇（2.959%）、異戊醇（20.284%）、芳樟醇（0.812%）、苯乙醇（2.463%）等。

表2 處理前后煙草萃取液中酯類致香成分比較Table 2 The comparison of the esters in tobacco extract

2.2.4 酮類物質(zhì)含量比較分析 據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，中性香氣成分是影響煙葉的重要化學(xué)成分，研究者常用其含量多少來衡量煙葉香氣的強(qiáng)弱。煙草中主要的中性香氣物質(zhì)有β－紫羅蘭酮、β－大馬酮、茄酮、巨豆三烯酮、香葉基丙酮等[8]。酮類物質(zhì)是煙草萃取液中重要的香氣物質(zhì)。經(jīng)過釀酒酵母轉(zhuǎn)化發(fā)酵后的煙草萃取液酮類致香成分增加至13種，如表4所示。從主要酮類物質(zhì)的種類和含量以及煙草萃取液中所有酮類物質(zhì)和含量上看轉(zhuǎn)化后的煙草萃取液香氣（酮類物質(zhì)總量為15.549%）要明顯優(yōu)于未處理的煙草萃取液（酮類物質(zhì)總量為12.352%）。處理后的煙草萃取液較未處理的煙草萃取液增加了2，3－戊二酮（0.795%）、3－庚酮（0.303%）、α－紫羅蘭酮（0.143%）等物質(zhì)，茄酮含量增加至8.502%。

表4 處理前后煙草萃取液中酮類致香成分比較Table 4 The comparison of the ketones between tobacco extract and control

2.2.5 醛類物質(zhì)含量比較分析 經(jīng)過GC/MS分析得出處理后的煙草萃取液醛類物質(zhì)有6種，如表5所示。處理前后的煙草萃取液醛類物質(zhì)種類數(shù)增加了3種，分別是3－乙氧基丙醛（0.028%）、壬醛（0.026%）和2－吡咯甲醛（0.051%），但是醛類致香物質(zhì)的含量總量下降，這是否為釀酒酵母轉(zhuǎn)化過程中消耗所致，有待探討。

表5 處理前后煙草萃取液中醛類致香成分比較Table 5 The comparison of the aldehydes between tobacco extract and control

2.2.6 烯烴和烯烴衍生物物質(zhì)含量比較分析 未處理煙草萃取液中所含的烯烴和烯烴衍生物總量僅有0.18%，處理后的煙草萃取液經(jīng)過GC/MS分析得出烯烴和烯烴衍生物物質(zhì)有4種，如表6所示。較未處理的煙草萃取液主要增加了苯乙烯、新植二烯等致香成分，其中苯乙烯是有特殊香氣的油狀液體，對(duì)煙草香氣清新愉悅有一定貢獻(xiàn)。新植二烯在煙草燃燒時(shí)可直接進(jìn)入煙氣，這種萜烯類化合物本身具有一定的清香氣[9]。

表7 處理前后的煙草萃取液涂布煙草片基吸食評(píng)價(jià)Table 7 The smoking evaluation of the tobacco sheet coated tobacco extract

表6 處理前后煙草萃取液中烯烴和烯烴衍生物致香成分比較Table 6 The comparison of the olefins and olefins derivatives in tobacco extract

2.3 評(píng)吸結(jié)果

由表7評(píng)吸結(jié)果可以看出，經(jīng)過釀酒酵母轉(zhuǎn)化后的煙草萃取液涂布煙草片基后，對(duì)其吸食品質(zhì)有一定程度的改善，煙草片基中的余味、灼燒感等均明顯降低，香氣增加，產(chǎn)了令人較愉悅的香氣。

3 結(jié)論

初步得出釀酒酵母處理煙草萃取液的基本工藝條件是：煙草萃取液的濃度為30%，酵母添加量為15g/L煙草萃取液，轉(zhuǎn)化溫度30℃，靜置或攪拌轉(zhuǎn)化時(shí)間為4h。如此短的時(shí)間處理，是因?yàn)榻湍柑砑恿枯^大。這對(duì)于快速處理煙草萃取液顯然是有利的。

經(jīng)處理后的煙草萃取液采用SPME和GC/MS對(duì)其中揮發(fā)性致香成分進(jìn)行分析檢測，共檢測出83種成分，其中有6種酸，16種醇，13種酮，6種醛，10種酯，4種烯烴和烯烴衍生物。而未處理的煙草萃取液只檢測出48種成分，其中有2種酸，9種醇，9種酮，4種醛，5種酯，1種烯烴和烯烴衍生物。處理后的煙草萃取液在酸類、醇類、酮類、酯類、烯烴和烯烴衍生物的種類和總量上均比未處理的煙草萃取液有所增加。

釀酒酵母處理對(duì)再造煙葉的煙氣平衡作用明顯，且增加了香味物質(zhì)，處理后的再造煙葉煙氣協(xié)調(diào)性更好，余味明顯改善，并且含有香氣成分。因此，釀酒酵母在煙草萃取液中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用值得深入研究。

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Improve the aroma characteristics of the tobacco extracts by saccharomyces cerevisiae

ZHANG Chen1，2，XU Gan-rong1，*，YAN Xin-long3
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；
2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Taicang Tobacco Sheet Co.，Ltd.，Suzhou 215400，China）

In the preparation of reconstituted tobacco sheet by paper-making method，saccharomyces cerevisiae was used to ferment the concentrated tobacco extracts.The flavoring compositions of the fermented tobacco extracts analyzed by headspace solid-phase micro-extraction（HS-SPME）associated with capillary gas chromatography-mass-spectrometry（GC-MS），the results showed that：48 flavoring components were detected from unprocessed tobacco extract，and 83 flavoring components were detected from the treated tobacco extract.The contents of acids，ketones，esters，olefin and others after fermentation increased in various degrees，indicating that the flavoring effect was obvious after yeast fermentation of the extracts.The sensory quality of the reconstituted tobacco leaf which was coated with the fermented tobacco extracts was evaluated.The result indicated that the tobacco extract which treated by sacchaomyces cerevisiae could significantly improve smoking quality.

reconstituted tobacco leaf；tobacco extract；saccharomyces cerevisiae；flavoring components

TS44+4

B

1002-0306（2012）20-0137-05

2012－05－08 *通訊聯(lián)系人

張晨（1988-），男，碩士研究生，研究方向：生物資源的開發(fā)與利用。