付 敏，趙強(qiáng)忠，仇超穎，劉 寧，趙謀明

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

果糖月桂酸單酯的分離純化及鑒定

付 敏，趙強(qiáng)忠，仇超穎，劉 寧，趙謀明*

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510640）

采用硅膠柱層析色譜對(duì)叔戊醇中固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖月桂酸單酯進(jìn)行分離純化。確定了薄層層析（TLC）條件，并通過反相-高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)（RP-HPLC-ELSD）測(cè)定柱層析純化產(chǎn)物的純度。利用液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-ESI-MS）、紅外光譜（FT-IR）和13C核磁共振（13CNMR）對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)，鑒定目標(biāo)產(chǎn)物為酯化位點(diǎn)在1位和6位的果糖月桂酸單酯，四種異構(gòu)體如下：1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯、1-月桂酸-α-D-吡喃果糖單酯、1-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯和6-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯，且1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯的比例最高。

果糖月桂酸單酯，固定化磷脂酶Lecitase?Ultra，薄層層析，硅膠柱層析，結(jié)構(gòu)

高級(jí)脂肪酸糖酯具有兩親結(jié)構(gòu)，是一類重要的非離子表面活性劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)，具有無毒、無臭、無刺激、易生物降解等優(yōu)點(diǎn)[1]。糖酯的合成方法有化學(xué)法和酶法：相對(duì)化學(xué)法的生產(chǎn)能耗高且產(chǎn)品的酯化位置和酯化度不易控制，酶法合成則具有高效性和特異選擇性、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物較少等特點(diǎn)。在酶催化合成糖酯的研究中，簡(jiǎn)捷、方便的分析方法是優(yōu)化合成工藝，提高轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵。常用糖酯分離純化的方法如下：TLC是最常用的方法[2]，可以方便快速地對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性定量測(cè)定；硅膠柱層析色譜分離法，操作簡(jiǎn)單，是大量制備純品的良好選擇，常用的洗脫劑為氯仿、甲醇、乙酸乙酯等[3]；氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[4]需要對(duì)糖酯衍生化，由于衍生化過程較復(fù)雜，因此限制了其應(yīng)用；高效液相色譜（HPLC）[5]，分離效果好，測(cè)定靈敏度高，但此法分離成本較高，且分離量小，難以大量制備樣品。磷脂酶Lecitase?Ultra（E.C.3.1.1.32）是Novozymes公司推出的一種微生物來源的磷脂酶，同時(shí)具有較高的脂肪酶活性和磷脂酶活性[6]，價(jià)格是同類脂肪酶的10%～15%。因此，本實(shí)驗(yàn)以叔戊醇為溶劑，利用固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成果糖月桂酸單酯，采用硅膠柱層析梯度洗脫對(duì)其進(jìn)行分離純化，并對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。本研究可為分離鑒定果糖月桂酸單酯提供比較系統(tǒng)的理論平臺(tái)，為其進(jìn)一步的生產(chǎn)和研究提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷脂酶Lecitase?Ultra 丹麥諾維信公司；大孔吸附樹脂 天津海光化工有限公司；D-果糖 上海伯奧生物科技有限公司；月桂酸 天津市大茂化學(xué)試劑廠；硅膠板G 青島普科分離材料有限公司；柱層析硅膠 80～100目，青島海洋化工廠分廠；4?分子篩 天津市福辰化學(xué)試劑廠；叔戊醇（AR級(jí)） 上海阿拉丁公司；甲醇，氯仿等 均為分析純。

754分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；S20 pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；DZF-6000真空干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；THZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；Waters 600高效液相色譜儀 美國Waters公司；3300（ELSD 3300）蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國A lltech公司；Esquire HCT PLUS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Vector 33傅里葉變換紅外譜儀、AVANCE Digital 400MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 磷脂酶Lecitase?Ultra的固定化[7]室溫下，以大孔吸附樹脂DA-201為載體，對(duì)磷脂酶Lecitase?Ultra進(jìn)行吸附法固定化：以pH=7.0，0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液為媒介，加酶量30mg/g樹脂，吸附時(shí)間4h；真空干燥后，備用。

1.2.2 固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成果糖月桂酸單酯 250m L具塞玻璃瓶中加入2g果糖，7g月桂酸和80m L脫水叔戊醇，置于恒溫振蕩器中預(yù)平衡1h后加入5g 4?分子篩，1.3g固定化磷脂酶，43℃下，160r/m in反應(yīng)72h。

1.2.3 反應(yīng)液TLC分析 取酶促反應(yīng)液點(diǎn)于薄板的底端，在選用的展開劑中上行展開。顯色劑為lg脲溶于4.5m L 85%磷酸和48m L水飽和的正丁醇混合溶液[8]，將揮干的硅膠板浸漬于顯色劑中2m in，自然晾干，105℃烘5m in，斑點(diǎn)為藍(lán)色。

1.2.4 產(chǎn)物硅膠柱層析分離 將反應(yīng)液過濾去除分子篩和酶（回收），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，將固體微熱溶于氯仿∶甲醇=2∶1（v∶v），再通過硅膠層析柱分離制備。取濃縮液5m L上硅膠層析柱（硅膠80～100目，柱30× 500mm），收集洗出液，并用TLC監(jiān)測(cè)，合并斑點(diǎn)相同的組分。

1.2.5 產(chǎn)物純度分析 將收集到的目標(biāo)組分通過RP-HPLC-ELSD進(jìn)行純度測(cè)定，按峰面積歸一化法計(jì)算產(chǎn)物純度。

色譜柱XBridge C18（5μm，4.6×150mm），流動(dòng)相為甲醇/水=90∶10（v∶v）[9]，流速為0.5m L/m in，柱溫20℃，進(jìn)樣量10μL，ELSD漂移管溫度40℃，載氣流速1.5L/m in。

1.2.6 產(chǎn)物HPLC-ESI-MS分析[10]稱取5mg收集到的目標(biāo)組分溶于5m L色譜純甲醇中，取5μL進(jìn)行分析。

色譜條件：色譜柱XBridge C18（5μm，4.6×150mm）；流動(dòng)相為甲醇/水=80∶20（v∶v），流速0.6m L/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫25℃。

質(zhì)譜條件（MS）：電噴霧（ESI）離子源，正離子模式，毛細(xì)管電壓為188V，錐孔電壓為40V，質(zhì)荷比的范圍m/z為100～600。

1.2.7 產(chǎn)物FT-IR分析 分離純化的產(chǎn)物用FT-IR通過KBr壓片法測(cè)定其結(jié)構(gòu)，取約200mg KBr置于瑪瑙缽中研碎，紅外燈干燥，加5mg左右的樣品，研勻、壓片，在400～4000cm-1范圍內(nèi)掃描，掃描8次，分辨率4cm-1，得到純化產(chǎn)物的紅外吸收光譜。

1.2.8 產(chǎn)物13C NMR分析 稱取收集到的目標(biāo)組分100mg，以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，采用超導(dǎo)核磁共振譜儀，以氘代甲醇為溶劑[11]，30℃，采用400MHz掃描，碳譜的脈沖寬度為12.75μs，脈沖功率為3.0dB，共振頻率為100.62MHz，循環(huán)延遲2s，掃描1000次。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)液TLC分析

影響TLC對(duì)混合物進(jìn)行分離效果的三個(gè)主要因素分別為：被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性和展開劑的極性。在本實(shí)驗(yàn)中被分離物質(zhì)的極性和硅膠的活性是恒定的，因此主要通過改變展開劑的極性提高分離效果。

表1 展開劑組成對(duì)合成果糖月桂酸單酯的反應(yīng)液分離效果的影響Table 1 Effectofmobile phase composition on separation of monolauroyl fructose

2.2 產(chǎn)物硅膠柱層析分離

硅膠吸附色譜分離一組極性不同的混合物時(shí)，可以通過調(diào)節(jié)洗脫劑的極性來達(dá)到較好的分離效果。果糖為強(qiáng)極性化合物，月桂酸為弱極性化合物，反應(yīng)生成的果糖月桂酸單酯為中等極性化合物，鑒于極性的差異，可將產(chǎn)物進(jìn)行有效地分離。Gulten Sekeroglu[12]利用硅膠柱層析對(duì)合成的糖酯進(jìn)行純化，獲得良好的分離效果。

在本實(shí)驗(yàn)中，為分離純化和大量制備果糖月桂酸單酯，將優(yōu)化的TLC分離條件應(yīng)用于硅膠柱層析，即選用氯仿∶甲醇作為流動(dòng)相，再通過對(duì)流動(dòng)相比例、洗脫方式、洗脫速度、進(jìn)樣量各因素進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳色譜條件：依次采用100%氯仿、氯仿∶甲醇= 93∶7（v∶v）、氯仿∶甲醇=90∶10（v∶v）進(jìn)行梯度洗脫，1.2m L/min，上樣量為25g/g硅膠。產(chǎn)物獲得良好的分離效果，結(jié)果如圖1所示，隨著洗脫溶劑極性的增大，月桂酸、果糖月桂酸單酯和果糖依次洗脫下來。

圖1 固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖單酯的硅膠柱層析Fig.1 Silica gel column chromatography ofmonolauroyl fructose catalyzed by immobilized Lecitase?Ultra

2.3 產(chǎn)物純度分析

對(duì)硅膠柱層析分離純化的目標(biāo)產(chǎn)物果糖月桂酸單酯進(jìn)行純度檢測(cè)。在酯類化合物的研究中大多采用反相HPLC對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，常用的紫外檢測(cè)器（UV）和示差檢測(cè)器（RID）用于糖酯分析時(shí)并不理想，使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），可以取得較好的效果[13]。因此本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC-ELSD對(duì)硅膠柱層析純化后產(chǎn)物進(jìn)行純度分析。圖2即為硅膠柱層析純化后的果糖月桂酸單酯HPLC分析圖譜，在實(shí)驗(yàn)條件下，果糖月桂酸單酯的保留時(shí)間為5.402m in。由圖2中得知純化后的果糖月桂酸單酯得到單一色譜峰，根據(jù)面積歸一化法，果糖月桂酸單酯的純度大于99%[14]。因此硅膠柱層析能夠很好地分離固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖酯產(chǎn)物，可用于純化產(chǎn)物。

圖2 硅膠柱層析純化的果糖單酯HPLC-ELSD圖譜Fig.2 HPLC chromatographic analysis ofmonolauroyl fructose purified by Silica gel column chromatography

2.4 產(chǎn)物HPLC-ESI-MS分析

液質(zhì)聯(lián)用結(jié)合了液相色譜對(duì)微量樣品測(cè)量的靈敏性和質(zhì)譜對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的測(cè)定的準(zhǔn)確性，因此是一種有效的分析物質(zhì)的方法。ESI離子源適用于電離極性大且非揮發(fā)性的大分子物質(zhì)，如天然的表面活性劑對(duì)其有較好的響應(yīng)，且具有極低的檢測(cè)極限。脂肪酸糖酯是一類非離子表面活性劑，因此運(yùn)用HPLC-ESI-MS對(duì)脂肪酸糖酯進(jìn)行鑒定具有良好的操作性和高靈敏性。朱金麗等[15]已利用ESI-MS對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸蔗糖酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)上述硅膠柱層析分離純化的果糖月桂酸單酯進(jìn)行HPLC-ESI-MS分析，結(jié)果如圖3所示。譜圖中出現(xiàn)[M+Na]、[M-H2O+Na]和[M+2H2O+K]質(zhì)譜信號(hào)峰分別為385.3、367.3、437.3，所對(duì)應(yīng)的M值和果糖月桂酸單酯的分子量362相符合，由此得知，硅膠柱層析分離純化的果糖酯為果糖月桂酸單酯。

圖3 果糖月桂酸單酯HPLC-ESI-MS圖譜Fig.3 HPLC-MS chromatographic analysis of monolauroyl fructose

2.5 產(chǎn)物FT-IR分析

圖4 果糖月桂酸單酯的FT-IR圖譜Fig.4 FT-IR spectrum ofmonolauroyl fructose

FT-IR光譜提供了化合物中特定官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)紅外吸收光譜圖中特征吸收峰的位置、數(shù)目、相對(duì)強(qiáng)度和形狀等參數(shù)可判斷樣品中存在哪些基團(tuán)，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行歸類分析。果糖脂肪酸單酯的特征官能團(tuán)為羥基和酯基。由圖4可以看出，3388cm-1寬而鈍的峰為締合的-OH的伸縮振動(dòng)吸收，1736cm-1的強(qiáng)峰為-C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰，是酯的特征吸收峰。同時(shí)從2923、1464cm-1的較強(qiáng)吸收和1379cm-1的較弱吸收可以看出樣品-CH2多而-CH3少；在1700cm-1處沒有明顯的吸收峰，故可判斷分離組分不含月桂酸。綜上可知，經(jīng)硅膠柱層析分離純化的果糖酯為果糖月桂酸單酯。

2.6 產(chǎn)物13C NMR分析

在叔戊醇中，呋喃型果糖和吡喃型果糖同時(shí)存在。兩種形式的果糖分別存在兩種差向異構(gòu)體，即α型和β型，因此D-果糖在叔戊醇中存在有4種構(gòu)象，分別是β-D-吡喃果糖、α-D-吡喃果糖、β-D-呋喃果糖和α-D-呋喃果糖。圖5即為固定化磷脂酶Lecitase?Ultra在脫水叔戊醇中催化果糖與月桂酸的酯化產(chǎn)物。由于吡喃型的六元環(huán)和β構(gòu)型是優(yōu)勢(shì)構(gòu)象，因此四種構(gòu)象中以β-D-吡喃果糖占的比例最大，在參與酯化的過程中，其優(yōu)勢(shì)構(gòu)象參與反應(yīng)的機(jī)率更大[16]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)純化后的果糖月桂酸單酯進(jìn)行13C NMR分析，并結(jié)合HPLC-MS和FT-IR分析結(jié)果，如圖6所示，判定產(chǎn)物中共有4種組分[11，17]，分別為：（Ⅰ）1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯（l-lauroyl-β-D-fructopyranose）、（Ⅱ）1-月桂酸-α-D-吡喃果糖單酯（1-lauroyl-α-D-fructopyranose）、（Ⅲ）1-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯（1-lauroyl-β-D-fructofuranose）、（Ⅳ）6-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯（6-lauroyl-β-D-fructofuranose）。從圖譜的信號(hào)強(qiáng)度可知，四種組分的比例為3∶2∶1.1∶1（Ⅰ∶Ⅳ∶Ⅱ∶Ⅲ），由此可見，?；x擇性地發(fā)生在果糖分子的1位和6位羥基上，并主要以1位羥基為主，與β-D-吡喃果糖為優(yōu)勢(shì)構(gòu)象相符。表2為果糖月桂酸單酯的13C NMR的化學(xué)位移數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

3.1 確定了TLC分析條件：展開劑為氯仿/甲醇/乙酸/水（81∶9∶8∶2，v∶v∶v∶v）；顯色劑為lg脲溶于4.5m L 85%磷酸和48m L水飽和的正丁醇混合溶液，結(jié)果得到果糖月桂酸單酯的Rf值為0.54。

圖5 固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖與月桂酸酯化產(chǎn)物Fig.5 Reaction products of the enzymaticmonoacylations of fructose catalyzed by immobilized Lecitase?Ultra

圖6 果糖月桂酸單酯在果糖區(qū)域段13C-NMR圖譜Fig.6 13C-NMR spectrum in the sugar region of monolauroyl fructose

3.2 采用硅膠柱層析對(duì)固定化磷脂酶Lecitase?Ultra催化合成的果糖月桂酸單酯進(jìn)行分離純化，最佳色譜條件：依次采用100%氯仿、氯仿∶甲醇=93∶7（v∶v）、氯仿∶甲醇=90∶10（v∶v）進(jìn)行梯度洗脫，1.2m L/m in，上樣量為25g/g硅膠。TLC監(jiān)測(cè)并收集洗出液，通過RPHPLC-ELSD鑒定目標(biāo)產(chǎn)物純度大于99%。

3.3 對(duì)柱層析純化樣品進(jìn)行系統(tǒng)的分析鑒定，分別采用HPLC-ESI-MS、FT-IR、13C NMR手段鑒定了目標(biāo)產(chǎn)物為果糖月桂酸單酯，并確定四種單酯異構(gòu)體：1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯、1-月桂酸-α-D-吡喃果糖單酯、1-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯和6-月桂酸-β-D-呋喃果糖單酯，其中1-月桂酸-β-D-吡喃果糖單酯的比例最高。

表2 不同果糖月桂酸單酯同分異構(gòu)體的13CNMR的化學(xué)位移數(shù)據(jù)（δ，ppm）Table 2 13C chemical shifts in CD3OD for the various fructose lauric isomers（δ，ppm）

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Purification and identification ofmonolauroyl fructose

FU M in，ZHAO Qiang-zhong，QIU Chao-ying，LIU Ning，ZHAO M ou-m ing*
（College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

A novel enzymatic-catalyzing p rocess of monolauroyl fructose was developed.In the p rocess immobilized Lecitase?Ultra was used as biocatalyst in anhyd rous 2-methyl-2-butanol.Silica gel column chromatog raphy was used to separate and purify the fructose ester.The qualitative analysis condition of TLC was confirmed and the purity was identified by RP-HPLC-ELSD.Structure was verified by HPLC-ESI-MS，F(xiàn)TIR，13C NMR.As a result，a m ixture of the C-1 and C-6 monoacylated frutose esters，four isomers ofmonolauroyl fructose were obtained：l-lauroyl-β-D-fructopyranose，1-lauroyl-α-D-fructopyranose，1-lauroyl-β-D-fructofuranose，6-lauroyl-β-D-fructofuranose，and l-lauroyl-β-D-fructopyranose was the highest p roportion.

monolauroyl fructose；immobilized Lecitase?Ultra；TLC；silica gel column chromatography；structure

TS202.3

B

1002-0306（2012）22-0276-05

2012－05－17 *通訊聯(lián)系人

付敏（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

粵港招標(biāo)項(xiàng)目（2009A020700003）；國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2010AA101505）。