陳國(guó)花 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 266600）

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H3N2亞型豬流感病毒多克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立

陳國(guó)花 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 266600）

本試驗(yàn)將初步純化的H3N2豬流感病毒注入到新西蘭大白兔體內(nèi)，獲得了抗豬流感病毒多克隆抗體，以純化后的豬流感病毒為抗原，初步建立了間接ELISA檢測(cè)方法，確定了抗原最佳包被濃度為41.25μg/ml，血清的最佳稀釋度為1:400，酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度為1:1000，一抗的最佳作用時(shí)間為30min。

H3N2 豬流感病毒 多克隆抗體 間接ELISA

豬流感(Swine Influenza , SI)是全世界養(yǎng)豬國(guó)家常遇到的一種呼吸道疾病[1]。SIV屬正粘病毒科A型流感病毒[2]，對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞具有高度親嗜性，故SIV感染的主要部位是支氣管和細(xì)支氣管上皮；呼吸道末梢部分的黏膜感染是誘發(fā)豬肺炎的重要原因。豬具有AIV和人流感病毒的受體，成為毒株間基因重配的活載體[3]，因此豬在流感病毒的禽-豬-人的種間傳播過(guò)程中，扮演著流感病毒中間宿主和多重宿主的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、紫外分光光度計(jì)UV2550(日本島津公司)、5ml注射器、漩渦震蕩器MM-1(恒豐儀器廠)。

1.1.2 主要試劑 H3N2亞型的SIV、新鮮雞紅細(xì)胞、甲醛、生理鹽水、弗氏不完全佐劑(FIA)弗氏完全佐劑(FCA)(Sigma公司)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)。試劑由諸城市畜牧局檢測(cè)中心實(shí)險(xiǎn)室保存。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 雞1只、新西蘭大白兔2只。

1.2 方法

1.2.1 SIV的純化 甲醛處理的紅細(xì)胞吸附釋放法。（1）取1ml 50%新鮮雞紅細(xì)胞加入1ml36%甲醛，充分混勻。（2）置4℃48h，每隔3h混勻1次。（3）2000rpm離心10min后棄去上清，剩余沉淀物中加入10ml生理鹽水混勻。（4）2000rpm離心10min后棄去上清，然后加入10ml生理鹽水進(jìn)行再次洗滌，重復(fù)洗滌6次。（5）加500ml生理鹽水配成50%甲醛處理過(guò)的雞紅細(xì)胞懸液。（6）取現(xiàn)有的SIV15ml，2000rpm離心30min后去沉渣，收集上清液。（7）取600ml 50%甲醛處理過(guò)的雞紅細(xì)胞懸液加入剛收集的上清液中，混勻，置4℃40min。（8）1500rpm離心10min后棄上清(另外收集該上清測(cè)血凝效價(jià))。（9）殘留沉淀物中加入500ml生理鹽水，37℃水浴4h，每隔20min震搖1次。（10）1500rpm離心10min后收取上清并檢測(cè)血凝效價(jià)。

1.2.2 SIV濃度的測(cè)定 用生理鹽水作空白對(duì)照，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化的SIV的OD280nm，OD260nm，計(jì)算SIV濃度。計(jì)算公式為：病毒濃度(mg/ml)=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm。

1.2.3 多克隆抗體的制備 取2只2.5~3kg新西蘭大白兔，用純化的SIV與等量弗氏完全佐劑完全乳化后，脊柱兩側(cè)選6~8點(diǎn)皮下注射，2mg/只。二免、三免、四免分別于首免后2、4和6周用弗氏不完全佐劑與SIV乳化后作為抗原進(jìn)行注射，部位相同，3mg/只。四免后心臟采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 間接ELISA反應(yīng)程序 （1）包被：將抗原用包被液稀釋，加入96孔板，100μl/孔，置濕盒，4℃過(guò)夜。（2）洗滌：甩干包被液，用PBST洗滌3~5次，3~5min/次。（3）封閉：加入封閉液，100μl/孔，置濕盒，37℃孵育1h，甩干，同上洗滌。（4）加樣：血清用抗體稀釋液適當(dāng)稀釋，100μl/孔，置濕盒，37℃孵育1h，甩干，同上洗滌。（5）加二抗：用二抗稀釋液將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG稀釋至工作濃度，100μl/孔，置濕盒，37℃孵育1h，甩干，同上洗滌。（6）加底物：每孔加入新鮮配制的底物溶液，100μl/孔，避光顯色10min。（7）終止：加入2M H2SO4，50μl/孔，終止反應(yīng)。（8）測(cè)OD值：用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD490 nm。

1.2.5 最佳抗原和血清濃度的確定 以方陣法測(cè)定，將抗原自50、100、200、400、800、1600倍稀釋包被酶標(biāo)板，將陰陽(yáng)性血清自100、200、400、800、1600、3200倍稀釋酶標(biāo)板，作ELISA測(cè)定，用酶標(biāo)板測(cè)定490nm波長(zhǎng)下的OD值。取P/N最大，陽(yáng)性O(shè)D490nm值在1.0附近，稀釋倍數(shù)為最佳的抗原濃度，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的抗體稀釋度為最佳的抗體稀釋度。

1.2.6 二抗最佳稀釋度試驗(yàn) 以最適抗原包被濃度包被酶標(biāo)板，倒掉包被液，PBST洗滌4次，3~5min/次。封閉液封閉3h，PBST洗滌4次。血清按最佳稀釋度加入后反應(yīng)60min，PBST洗滌4次，兔抗豬IgG-HRP選擇1:500、1:1000、1:1500、1:2000四個(gè)稀釋度，作用完后加入底物來(lái)確定最佳的抗體稀釋度。

2 結(jié)果與分析

2.1 血凝效價(jià)

純化前SIV效價(jià)為2-9，純化后的SIV效價(jià)為2-9，前后保持一致。

2.2 病毒含量

紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化的SIV的OD280nm=0.780，OD260nm=0.414。因此，病毒濃度(mg/ml)=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm=1.45×0.780-0.74×0.414=0.825(mg/ml)。由于該濃度是稀釋5倍后的濃度，故原始濃度為4.125mg/ml。

2.3 最佳抗原和血清濃度

經(jīng)多次方陣試驗(yàn)，當(dāng)抗原1:100，血清1:400稀釋時(shí)，P/N最大，OD490nm值接近于1.0。所以選擇1:100為抗原最佳包被濃度(41.25μg/ml)，血清的最佳稀釋度為1:400。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 SIV最佳抗原包被濃度和最佳血清濃度的確定

2.4 酶標(biāo)二抗最適稀釋度的確定

SIV抗原和血清都按照最佳稀釋度進(jìn)行試驗(yàn)，封閉液選擇最佳封閉液，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG分別用1:500、1:1000、1:1500、1:2000四個(gè)稀釋度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 二抗最佳稀釋度的確定

從表2可以看出，當(dāng)二抗稀釋度為1:1000時(shí)，P/N比值最大，因此選擇酶標(biāo)抗體的最佳稀釋度為1:1000。

2.5 一抗最佳作用時(shí)間的確定

將一抗選取30min，60min，90min，120min 4個(gè)作用時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 血清最適結(jié)合時(shí)間的確定

從表3可以看出，當(dāng)抗原抗體的作用時(shí)間為30min時(shí)P/N比值最大，因此確定一抗的最佳作用時(shí)間為30min。

2.6 特異性試驗(yàn)

按照已建立的檢測(cè)方法，將豬細(xì)小(PPV)、豬圓環(huán)(PCV)、豬藍(lán)耳(PRRSV)包被ELISA板進(jìn)行特異性反應(yīng)的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4，從表4結(jié)果可以看出，與PPV、PCV、PRRSV的反應(yīng)均呈陰性，無(wú)交叉反應(yīng)性，表明該方法具有較好的特異性。

表4 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn)

3 討論與結(jié)論

病毒的純化一直是病毒學(xué)研究的一個(gè)難點(diǎn)，密度梯度離心是病毒純化最常用的方法[4,5]。該方法精密度較高，使用該方法如果密度梯度選擇恰當(dāng)可以受到比較滿意的效果，但是該方法操作過(guò)程比較繁瑣，需要特殊儀器設(shè)備-超速離心機(jī)。雞紅細(xì)胞表面含有血凝素的受體唾液酸，血凝素可以與之結(jié)合并發(fā)生凝集，隨后在一定的溫度條件下流感病毒又可與雞紅細(xì)胞分離，而使用甲醛處理過(guò)的雞紅細(xì)胞無(wú)溶血現(xiàn)象，因此根據(jù)流感病毒的這一特性可以使用甲醛處理的紅細(xì)胞吸附釋放法來(lái)純化流感病毒。通過(guò)2種純化流感病毒方法的對(duì)比研究，認(rèn)為甲醛處理的紅細(xì)胞吸附釋放法是一種操作簡(jiǎn)單，易于掌握，而且對(duì)設(shè)備要求不高，經(jīng)濟(jì)實(shí)用的純化流感病毒的方法，值得推廣，特別是使用甲醛處理過(guò)的雞紅細(xì)胞純化效果更理想。

ELISA盡管具有高靈敏、強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)，但是其結(jié)果卻受操作影響很大，每個(gè)步驟包括加樣、溫育、洗滌、顯色，都有可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不利影響。如洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也可能決定著試驗(yàn)的成敗。ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性的吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料等對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。如果洗滌不徹底，特別是在最后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，但是大家往往會(huì)忽略，這應(yīng)引起高度重視。

[1] 盧中華, 王自振, 王亞賓等. 豬流行性感冒[J]. 河南畜牧獸醫(yī). 2001 增刊. 86-88.

[2] 斯特勞.趙德明等譯. 豬病學(xué)(第8版)[M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2000, 665-669.

[3] Joe Vansickle Sr. Swine flu ranks third in pneumonia cases. National Hog Farmer.Nov 15, 2000. Vol. 45, Iss. 11; p. 14 (2 pages).

[4] 陳麗軍, 王英, 胡建華等. 應(yīng)用等密度梯度離心法提純傳染性支氣管炎病毒[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1998, 14(3):93-95.

[5] Lee KC, Lim D, Wong SM, et al.Purification, crystallization and X-ray analysis of hibiscus chlorotic ringspot virus[J]. Acta Crystallogr, 2003, 59(8):1481-1483.

（2011–11–14）

S859.79

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1007-1733(2012)02-0003-04