蘇 妮 孫振師 張化恒 （山東省萊西市畜牧獸醫(yī)局 266600）

奶牛早期妊娠診斷是提高奶牛繁殖率和產(chǎn)奶量的重要措施，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。最早應(yīng)用的早孕診斷方法是直腸檢查法，但此法確診時間晚，勞動強(qiáng)度大，診斷準(zhǔn)確率受技術(shù)水平和操作狀態(tài)的影響大，且診斷過程易對胚胎造成危害。所以自70年代開始，國內(nèi)外進(jìn)行了大量的實驗室早孕診斷方法的研究，如放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫乳膠凝集抑制試驗等，但這些診斷早孕的方法目前仍處于進(jìn)一步研究階段。為了探討適合廣大基層單位奶牛早孕診斷的方法，筆者對184頭配種后21～26d的奶牛分別用RIA.、ELISA、LAIT法進(jìn)行了早孕診斷的對比試驗研究。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及采樣

1.1.1 試驗動物 選擇發(fā)情配種后21～26d的黑白花奶牛184頭。

1.1.2 奶樣采集 取每頭奶牛上午擠的混合奶為奶樣，其中一部分脫脂后作RIA法測定。

1.1.3 脫激素乳的制備 取20ml乳樣加2.0g活性炭，磁力攪拌器攪拌30min，置冰箱內(nèi)過夜，2000r/min離心1h，取上清液同法每離心1次收集上清液即為去激素率98%的脫激素乳，用于ELISA法測定。

1.1.4 尿樣采集 取非晨時自然排出的尿液，用作LAIT的測定尿樣。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 RIA法的試劑與儀器 抗血清是以孕酮-11a-半琥珀酸鹽-RSA所免疫的家兔制備的，孕酮放射免疫藥盒由中國科學(xué)院動物研究所提供。

1.2.2 ELISA法試劑與儀器 抗血清同RIA法制備，辣根過氧化物酶（HRP.R2≈3.0），牛血清白蛋白，氯甲酸異丁酯，3，3′5，5′-四甲基苯胺（TMB），CP等。40孔ELISA微量測定板，S-ELISA-833型酶標(biāo)測定儀。酶結(jié)合物按Dawsow（1978）和Munro（1984）的混合酸酐法合成的孕酮-辣根過氧化物酶（P-11-HRP）。工作液按石放雄的方法制備。

1.2.3 LAIT法的試劑與儀器 免疫乳膠凝集抑制妊娠診斷試劑為衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所提供。

1.3 測定方法

1.3.1 RIA法 以Heap（1976）奶中孕酮分析法和中國科學(xué)院動物研究所的血漿孕酮分析法的操作程序進(jìn)行，孕酮標(biāo)準(zhǔn)曲線按Log-dose法在半對數(shù)紙上制作。測定范圍為0～800pg。

1.3.2 ELISA法 按石放雄（1987）操作程序，首先制作0～1000pg的典型孕酮濃度-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線和孕酮濃度-結(jié)合率標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后同法進(jìn)行乳樣測定，在酶標(biāo)定量儀上讀取440um下的光密度。

1.3.3 LAIT法 在清潔的載玻片上，加1滴待測尿樣，充分拌勻3min，在顯微鏡下（100×）觀察凝集抑制反應(yīng)。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)及準(zhǔn)確率的檢測

1.4.1 各測定方法的判定標(biāo)準(zhǔn) RIA與ELISA法的判定標(biāo)準(zhǔn)為21～26d奶中孕酮含量＞4.0ng/ml為陽性（懷孕）；奶中孕酮＜2.0ng/ml為陰性（未孕）；LIAT法判定標(biāo)準(zhǔn)：若出現(xiàn)均勻一致的凝集顆粒為陰性（空孕）；不出現(xiàn)凝集顆粒為陽性（孕牛）。

1.4.2 各測定方法準(zhǔn)確率的檢測 根據(jù)對不同妊娠的直檢診斷結(jié)果和配種、產(chǎn)犢記錄資料進(jìn)行準(zhǔn)確率的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同早孕診斷方法的準(zhǔn)確率

對配種后21～26d的184頭奶牛用RIA法診斷了51頭，用ELISA法診斷了55頭，用LAIT診斷了78頭，結(jié)果表明（表1）：RIA法與ELISA法對奶牛早孕診斷的準(zhǔn)確率基本一致，而LAIT法早孕診斷的準(zhǔn)確率明顯高于RIA與ELISA法。

表1 3種早孕診斷方法準(zhǔn)確率的比較

2.2 3種早孕診斷方法應(yīng)用價值分析

RIA與ELISA法其靈敏性基本一致 ，LAIT法靈敏性較高；RIA法每日可測150份奶樣，ELISA法每日可測200份奶樣，LAIT法每日可測400頭尿樣，所以LAIT法工作效率較高；RIA法與ELISA法操作復(fù)雜，所需試劑、儀器昂貴，而 LAIT法操作簡單，所用試劑、儀器簡單便宜。

3 小結(jié)與討論

（1）通過用RIA法、ELISA法和LAIT法分別對51頭、55頭、和78頭奶牛進(jìn)行的早孕診斷比較，診斷準(zhǔn)確率以LIAT法最高，達(dá)92.31%，比RIA法 與ELISA法分別提高8%和6.85%。（2）LIAT法和RIA法與ELISA法診斷的靈敏性高，操作簡單，容易掌握，工作效率高，且可現(xiàn)場測定，因此是基層生產(chǎn)單位值得大力推廣的奶牛早孕診斷方法。