烏云娜，莎麗娜，格日勒圖

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

高壓處理對牛骨骼肌原肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響

烏云娜，莎麗娜，格日勒圖*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

從牛骨骼肌中提取原肌球蛋白，施行0.1～400MPa的高壓處理，解壓后測定原肌球蛋白熒光光譜、光譜質(zhì)量中心、芳香族表面疏水性、脂肪族表面疏水性、表面巰基含量的變化來探討壓力對原肌球蛋白結(jié)構(gòu)的變化。熒光光譜強(qiáng)度及光譜質(zhì)量中心與對照組（0.1MPa）相比，隨著壓力的增加有逐漸下降趨勢，最大熒光波長發(fā)生藍(lán)移。100MPa時芳香族、脂肪族表面疏水基團(tuán)顯示出最低熒光強(qiáng)度值，壓力繼續(xù)升高時又逐漸上升。表面巰基含量在100MPa時大幅增長，隨著壓力的增加有緩慢的增長趨勢。從此結(jié)果可推測壓力引起原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)變化，而這些變化可能是一定程度的可逆性變化。

高壓處理，原肌球蛋白，光譜質(zhì)量中心，表面疏水性，巰基

肉類科學(xué)領(lǐng)域中，高壓處理可降低宰后肌肉僵直程度、促進(jìn)肌肉到食肉的變化、引起內(nèi)源性蛋白酶活性變化、對肌肉嫩化產(chǎn)生積極的作用[1-3]。為了解析這些變性機(jī)理有許多關(guān)于高壓對肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響方面的研究報(bào)道。Ikkai等[4]報(bào)道了高壓對肌動蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)在沒有ATP存在下＞150MPa時肌動蛋白發(fā)生不可逆變性，而在ATP存在下＞250MPa時發(fā)生不可逆變性，說明ATP可保護(hù)肌動蛋白受高壓而引起的變性。王志峰等[5]以及Gerelt等[6]從牛骨骼肌中提取G-肌動蛋白后進(jìn)行高壓處理，使用熒光光譜、圓二色光譜、核磁共振等分析，發(fā)現(xiàn)G-肌動蛋白在300MPa壓力時三級結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆變化。Chia-Ling等[7]對羅非魚肌球蛋白進(jìn)行50~300MPa壓力處理后發(fā)現(xiàn)，150MPa壓力時肌球蛋白變性，并隨著Ca2+-ATP酶活性的減少，肌球蛋白形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。但高壓對骨骼肌原肌球蛋白的影響極少。原肌球蛋白與肌動蛋白、肌鈣蛋白相互作用構(gòu)成細(xì)絲，在肌肉收縮過程中起重要調(diào)節(jié)作用。它由兩條平行的α-螺旋鏈（α、β鏈）相互纏繞組成，由284個氨基酸構(gòu)成，分子量在30～40ku之間，約占肌原纖維蛋白質(zhì)的5%~8%。以往對原肌球蛋白的研究主要集中于它的性質(zhì)及功能等[8-10]方面，而對它在高壓下的變化情況尚不明確。本實(shí)驗(yàn)從牛骨骼肌中提取原肌球蛋白，進(jìn)行不同程度的高壓處理，解壓后測定原肌球蛋白功能基團(tuán)的變化，探討壓力對原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)影響。通過本研究解明肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與機(jī)能的變性情況，并為高壓技術(shù)在肌肉蛋白質(zhì)的特性控制、促進(jìn)肌肉成熟、嫰化以及新產(chǎn)品的開發(fā)等方面提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛肉 購于呼和浩特市西口市場，宰后取自同一頭牛的后臀腿肉，取樣后在-20℃條件下保存；透析袋MD44 Solarbio公司；cis-parinaric acid（cPA）、ANSA（8-nalino-1-naphthalene sulphonic acid）、β-Mercaptoethanol 美國sigma公司；2，2-Dithiobis-（5-nitropyridine）（DTNP） 美國Aldrich公司；半胱氨酸 BBI公司。

QW-DJ18A多功能絞肉機(jī) 佛山市順德區(qū)奇?zhèn)ル娖饔邢薰荆籉SH-2高速勻漿機(jī) 常州國華電器有限公司；H2500R-2超速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；BG-Power600穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；UVWIN5可見紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原肌球蛋白的提取 原肌球蛋白的提取參考Bailey等[11]的方法，在低溫（2～4℃）條件下進(jìn)行。取肌肉組織100g破碎，a.加入等體積超純水，緩慢攪拌15min，高速勻漿1min。在4℃條件下靜置30min，兩層紗布過濾；b.濾出物等體積加入97%乙醇，充分?jǐn)嚢韬蠹啿歼^濾；c.濾出物加入4倍體積的50%乙醇、97%乙醇、乙醚各洗兩次，在通風(fēng)櫥里干燥成粉末；d.干燥物每100g加入700mL 1mol/L KCl，調(diào)pH至7.0；e.室溫下攪拌12h，紗布過濾（留濾液）；f.濾出物再次加入1mol/L KCl，攪拌1h后紗布過濾；g.濾液與e步濾液混合，調(diào)pH至4.3；h.10400×g條件下離心20min；i.沉淀加5倍體積的超純水充分溶解，調(diào)pH至7.0，攪拌加入0.7倍體積的飽和硫酸銨；j.10400×g條件下離心20min，上清加硫酸銨粉末至70%飽和度，4℃條件下靜置2h；k.18000×g條件下離心1h，沉淀在少量超純水里溶解，在大量超純水里透析24h；l.取出上清液加入粉末KCl至1mol/L濃度；返回第h步同樣操作重復(fù)兩次，第一次重復(fù)時硫酸銨粉末加至60%飽和度，第二次循環(huán)加至55%飽和度；m.最后一次透析在0.1mol/L KCl（pH7.0）溶液里透析24h，得到的上清液即為原肌球蛋白。

1.2.2 SDS-PAGE電泳分析 根據(jù)Leamml等[12]的方法，采用12.5%的分離膠與4.5%的濃縮膠進(jìn)行SDSPAGE電泳，檢測提取的原肌球蛋白純度。以考馬斯亮藍(lán)G-250染色。

1.2.3 高壓處理 根據(jù)Suzuki等[13]的方法對原肌球蛋白進(jìn)行高壓處理。在4℃條件下分別進(jìn)行100、200、300、400MPa壓力處理，保壓時間為5min，以常壓（0.1MPa）作為對照組。

1.2.4 光譜質(zhì)量中心的測定 光譜質(zhì)量中心的測定采用Ruan等[14]的方法，在室溫條件下進(jìn)行。用20mmol/L Tris-HCl（pH7.0）溶液將原肌球蛋白濃度調(diào)整為0.2mg/mL，激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長范圍為304～ 450nm，激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫10nm，掃描速度為中速，等條件下進(jìn)行熒光測定。由下列公式計(jì)算光譜質(zhì)量中心：

式中：[V]為質(zhì)量中心；Vi為波長的倒數(shù)；Fi為熒光強(qiáng)度。

1.2.5 芳香族表面疏水性的測定 芳香族表面疏水性的測定采用Boyer等[15]的方法，在室溫條件下進(jìn)行。用0.04mol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖溶液將樣品濃度調(diào)整為0.05mg/mL，鋁箔遮光的試管里加2.5mL樣品，加8μL 5mmol/L ANSA溶液，攪拌均勻后，在激發(fā)波長為380nm，發(fā)射波長為475nm條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。

1.2.6 脂肪族表面疏水基團(tuán)的測定 脂肪族表面疏水基團(tuán)的測定采用Boyer等[15]的方法，在室溫條件下進(jìn)行。用0.04mol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖溶液將樣品濃度調(diào)整為0.05mg/ml，2.5mL樣品加12.5μL 1mmol/L cPA溶液，攪拌均勻后，在激發(fā)波長為325nm，發(fā)射波長為410nm條件下進(jìn)行熒光強(qiáng)度測定。

1.2.7 表面巰基（-SH）含量的測定 表面巰基含量的測定采用小幡明雄等[16]的方法，在室溫條件下進(jìn)行。以半胱氨酸溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品溶液用0.1mol/L的磷酸緩沖液調(diào)整質(zhì)量濃度至0.6mg/mL。調(diào)好的樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00mL，加入5×10-4mol/L DTNP乙醇溶液0.5mL，0.5mL DTNP乙醇溶液，攪拌后室溫條件下反應(yīng)約20min。反應(yīng)結(jié)束后，添加2.50mL 10% HCIO4，在1000×g條件下離心15min除去蛋白質(zhì)。用濾紙（ADVANTEC 5C）過濾，取上清液在波長386nm處測定吸光度。

使用SAS方差分析，分析各實(shí)驗(yàn)組組間數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 原肌球蛋白SDS-PAGE電泳圖

從牛骨胳肌中提取原肌球蛋白后純度通過SDSPAGE電泳檢測，結(jié)果見圖1。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明提取的原肌球蛋白較純，沒有其他雜蛋白，圖中TM即為原肌球蛋白兩條肽鏈，出現(xiàn)了分子量分別約為36、38ku的兩個條帶。因此我們考慮用于以下實(shí)驗(yàn)。

圖1 原肌球蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE profile of tropomyosin

2.2 高壓處理對原肌球蛋白熒光光譜及光譜質(zhì)量中心的影響

圖2為壓力處理后的原肌球蛋白用20mmol/L Tris-HCl（pH7.0）溶液調(diào)整其質(zhì)量濃度至0.2mg/mL，在激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長為300～480nm下測得的熒光光譜圖。

圖2 高壓處理對原肌球蛋白熒光光譜及最大熒光波長的影響Fig.2 Effect of high pressure treatment on the fluorescence spectra and maximum wavelength of tropomyosin

由圖2中可以看出，原肌球蛋白熒光強(qiáng)度隨壓力的增加呈下降趨勢。此外，最大熒光波長由343nm移動到341nm，發(fā)生了藍(lán)移（右上圖）。圖3為根據(jù)以上的數(shù)據(jù)結(jié)果，計(jì)算出來的光譜質(zhì)量中心結(jié)果圖。原肌球蛋白光譜質(zhì)量中心隨著壓力的增加也呈下降趨勢，在100MPa時與對照組（0.1MPa）相比下降迅速（P＜0.05），表明原肌球蛋白受壓力影響較大，在壓力作用下結(jié)構(gòu)發(fā)生收縮現(xiàn)象，使得位于分子表面的酪氨酸（或色氨酸）殘基被包埋在分子內(nèi)部而降低了光譜質(zhì)量中心。隨著壓力的繼續(xù)增加下降緩慢，100MPa和200MPa以及300MPa和400MPa之間得差異不顯著，100MPa與300、400MPa之間差異顯著。以上結(jié)果可以推測原肌球蛋白受壓力后有一定的結(jié)構(gòu)上的變化，100MPa壓力對其作用較大，分子發(fā)生收縮現(xiàn)象，而在大于100MPa的壓力時這些結(jié)構(gòu)變化在解壓后有恢復(fù)現(xiàn)象，因此壓力對原肌球蛋白結(jié)構(gòu)的變化有一定程度的可逆性。此結(jié)果只是在280nm下測定的蛋白質(zhì)內(nèi)源性熒光物質(zhì)（酪氨酸）放射出的光強(qiáng)度來計(jì)算的質(zhì)量中心的變化，只能說明酪氨酸周邊的結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆性的變化，難于說明原肌球蛋白整體的結(jié)構(gòu)變化。

圖3 高壓處理對原肌球蛋白光譜質(zhì)量中心的影響Fig.3 Effect of high pressure treatment on the center of spectral mass of tropomyosin

2.3 高壓處理對原肌球蛋白芳香族表面疏水基團(tuán)的影響

蛋白質(zhì)疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的主要作用力，它對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能性質(zhì)具有重要的作用。ANSA熒光探針法是一種評價蛋白質(zhì)表面疏水性的方法，是水溶液中蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的一種反映。ANSA與芳香族氨基酸結(jié)合后在380nm激發(fā)波長下475nm處有最大吸收，且熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的表面疏水性成正相關(guān)[17]。本實(shí)驗(yàn)采用此方法測定了高壓處理后原肌球蛋白芳香族表面疏水基團(tuán)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 高壓處理對原肌球蛋白芳香族表面疏水基團(tuán)的影響Fig.4 Effect of high pressure treatment on the surface aromatic hydrophobicity of tropomyosin

由圖4可看出，與對照組（0.1MPa）相比，100MPa時芳香族表面疏水基團(tuán)略有降低（p＜0.05），而后隨著壓力的升高有上升趨勢（p＜0.05），200MPa時與對照組相比沒有顯著差異。100MPa時芳香族表面疏水基團(tuán)的降低可能是因?yàn)樵趬毫ψ饔孟略∏虻鞍追肿影l(fā)生了收縮現(xiàn)象，使得疏水性氨基酸隱藏在內(nèi)而降低了表面疏水性。而在200MPa時受壓力影響的原肌球蛋白分子有所恢復(fù)，表面疏水基團(tuán)與常壓時狀態(tài)相近，被包埋的芳香族疏水性氨基酸暴露出來而增加了表面疏水性。隨著壓力的繼續(xù)增加原肌球蛋白分子空間結(jié)構(gòu)逐步發(fā)生變化，壓力破壞了蛋白分子內(nèi)部疏水相互作用，產(chǎn)生和暴露了更多的疏水性區(qū)域，原肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

2.4 高壓處理對原肌球蛋白脂肪族表面疏水基團(tuán)的影響

原肌球蛋白分子中脂肪族疏水性氨基酸將近占總氨基酸的30%，在穩(wěn)定原肌球蛋白三維結(jié)構(gòu)中起到重要作用[8]。cPA是檢測脂肪族氨基酸疏水性常用的熒光探針，cPA與脂肪族氨基酸結(jié)合后在325nm激發(fā)波長下在410nm處有最大吸收，本實(shí)驗(yàn)采用此方法檢測壓力處理后原肌球蛋白脂肪族表面疏水性，結(jié)果如圖5所示。

圖5 高壓處理后原肌球蛋白脂肪族表面疏水基團(tuán)含量的變化Fig.5 Changes of surface aliphatic hydrophobicity content of tropomyosin after high pressure treatment

由圖5看出，脂肪族表面疏水基團(tuán)在100MPa時與對照組相比迅速下降（p＜0.05），這時脂肪族表面疏水基團(tuán)降低到最低值，原因可能是在壓力作用下原肌球蛋白分子的收縮使得脂肪族疏水性氨基酸隱藏在內(nèi)而降低了表面疏水性。這結(jié)果符合芳香族表面疏水基團(tuán)的變化規(guī)律。隨著壓力升高脂肪族表面疏水基團(tuán)又有緩慢上升趨勢（p＜0.05）。但與芳香族表面疏水基團(tuán)變化不同的是脂肪族表面疏水基團(tuán)在各個壓力下的變化均比常壓低，而芳香族表面疏水基團(tuán)到300MPa時比常壓有上升趨勢。脂肪族表面疏水性的緩慢增加可能是在壓力（>100MPa）作用下原肌球蛋白分子發(fā)生了解聚，或解壓過程中破壞了原有的疏水相互作用，隱藏在內(nèi)的疏水性殘基又暴露出來發(fā)生了結(jié)構(gòu)上的變化而造成。原肌球蛋白分子由α、β-兩條肽鏈組成，由284個氨基酸構(gòu)成，其中將近30%為脂肪族疏水性氨基酸，而芳香族疏水性氨基酸不到5%[8]，受壓力影響更多的脂肪族疏水性氨基酸發(fā)生收縮等結(jié)構(gòu)變化，這可能是壓力處理后的脂肪族疏水基團(tuán)的熒光強(qiáng)度比常壓低的原因之一。發(fā)生此原因的未知問題較多，因此有必要進(jìn)一步研究。

2.5 高壓處理對原肌球蛋白表面巰基基團(tuán)的影響

巰基是形成二硫鍵的原體，兩個巰基配對可形成一個二硫鍵。二硫鍵在維持蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)中扮演著重要的角色，它的形成對于蛋白質(zhì)穩(wěn)定其空間結(jié)構(gòu)和保持生理活性具有重要的影響，是蛋白質(zhì)折疊過程中的重要步驟[18]。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中巰基的氧化以及二硫鍵的斷裂都會引起巰基含量的變化，其含量變化可以反映出蛋白質(zhì)的變性程度。

圖6 高壓處理后原肌球蛋白表面巰基基團(tuán)含量的變化Fig.6 Change of surface sulfhydryl group of tropomyosin after high pressure treatment

從圖6可以看出，隨著處理壓力的升高表面巰基含量增加，在100MPa時與常壓相比增加了37.2%（p＜0.05，100MPa時的巰基含量與常壓時巰基含量的比值）。而在100MPa到400MPa之間增加較緩慢，100MPa和200MPa以及300MPa和400MPa之間得差異不顯著，100MPa與300、400MPa之間差異顯著。表明原肌球蛋白的巰基基團(tuán)在100MPa時受壓力影響較大，結(jié)構(gòu)上發(fā)生了變化，而在更高的壓力時變化緩慢，說明解壓后這些結(jié)構(gòu)變化有所恢復(fù)，因此壓力對原肌球蛋白結(jié)構(gòu)變化是可逆變化。此結(jié)果符合質(zhì)量中心的變化。原肌球蛋白α-鏈的190位上有一個半胱氨酸（Cys），β-鏈的36位和190位上有Cys，但190位上的Cys在分子中比較不穩(wěn)定[19]。受壓力影響，這些原有結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的變化，或?qū)е略∏虻鞍追肿娱g的二硫鍵斷裂形成巰基基團(tuán)而增加了表面巰基含量，造成了原肌球蛋白的表面巰基基團(tuán)增加。

3 結(jié)論

3.1 牛骨骼肌原肌球蛋白熒光強(qiáng)度隨壓力的升高有下降趨勢，最大熒光波長發(fā)生藍(lán)移。光譜質(zhì)量中心在100MPa時與常壓（0.1MPa）相比下降迅速，隨著壓力的繼續(xù)增加下降緩慢，在100MPa和200MPa以及300MPa和400MPa之間得變化不顯著。壓力對原肌球蛋白結(jié)構(gòu)的變化可能是可逆變化。

3.2 牛骨骼肌原肌球蛋白芳香族、脂肪族表面疏水基團(tuán)在100MPa時與常壓（0.1MPa）相比有下降趨勢，壓力繼續(xù)升高時又開始緩慢上升。但不同的是芳香族表面疏水基團(tuán)到300MPa時比常壓有上升趨勢，而脂肪族表面疏水基團(tuán)比常壓低。這可能與受壓力影響的疏水性氨基酸數(shù)量有關(guān)。

3.3 牛骨骼肌原肌球蛋白表面巰基基團(tuán)含量在100MPa時與常壓（0.1MPa）相比增加了37.2%，而在100MPa和200MPa以及300MPa和400MPa之間得增加不顯著。表明壓力作用下原肌球蛋白分子間的二硫鍵斷裂形成巰基，但解壓后這些結(jié)構(gòu)變化有所恢復(fù)，有一定程度的可逆性。

由以上結(jié)果推測：從此結(jié)果可推測100MPa以上的壓力引起原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)變化，而這些變化可能是一定程度的可逆性變化。

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Effect of high pressure treatment on the structure of bovine skeletal muscle tropomyosin

WU Yun-na，SHA Li-na，Gerelt*
（College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China）

Tropomyosin was prepared from bovine skeletal muscle and then exposed to high pressures ranging from 0.1 to 400MPa.The pressure-induced structural change of tropomyosin was explored in terms of fluorescence spectrum，center of spectral mass，the surface aromatic and aliphatic hydrophobicity，and the amount of surface sulfhydryl group after releasing pressure.The fluorescence intensity and the center of spectra mass were decreased gradually with increase of pressure compared with the control（0.1MPa），and the fluorescence spectrum of tropomyosin exhibited a blue shift due to exposure to higher pressure.The amounts of surface aromatic and aliphatic hydrophobicity were reached its minimum value exposed to pressure of 100MPa and then increased gradually with the pressure increase.The amount of surface sulfhydryl group was increased greatly exposed to pressure of 100MPa and then increased gradually with the increase of pressure. Therefore，high pressure induced the structural change of tropomyosin which might be reversible.

high pressure；tropomyosin；center of spectral mass；surface hydrophobicity；sulfhydryl group

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）03-0052-05

2011－01－20 *通訊聯(lián)系人

烏云娜（1986-），女，碩士，研究方向：肉類科學(xué)。

國家自然基金項(xiàng)目（20676058）。