張 慧，吳 穎，*，朱 蕾，路 勇，張衛(wèi)民，姜 潔

(1.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，北京100026; 2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京100041)

超高效液相色譜法檢測(cè)飲料中納他霉素的含量

張 慧1，吳 穎1，*，朱 蕾1，路 勇2，張衛(wèi)民2，姜 潔2

(1.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，北京100026; 2.北京市食品安全監(jiān)控中心，北京100041)

建立用超高效液相色譜測(cè)定飲料中納他霉素含量的方法。用甲醇溶液提取樣品中的納他霉素，UPLC分析，外標(biāo)法定量。采用BEH Shield RP18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為303nm，以乙酸銨和乙腈為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫。該方法操作簡(jiǎn)單快捷，方法準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性好。

超高效液相色譜，納他霉素，檢測(cè)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品 Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、乙酸銨 色譜級(jí)，Dikma公司;實(shí)驗(yàn)用水 超純水。

Waters ACQULITY UPLC超高效液相色譜儀配有光電二極管矩陣(PDA)檢測(cè)器;高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)SIGMA公司;旋渦混合器;色譜柱ACQULITY UPLC BEH Shield RP18(2.1mm×50mm，1.7μm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 稱取飲料類樣品5g(精確至0.01g)，用甲醇定容至25mL，超聲10min，10000r/min冷凍離心10min，取上清液過0.25μm濾膜，待儀器進(jìn)樣使用。

1.2.2 色譜分析條件 采用BEH Shield RP18色譜柱，分別選取流動(dòng)相甲醇－水、乙腈－水、乙腈－5mmol乙酸銨、乙腈－10mmol乙酸銨、乙腈－20mmol乙酸銨，同時(shí)對(duì)不同流速、不同控制溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、線性范圍及最低檢出限 精密稱取1mg(精確到0.1mg)納他霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇定容至10mL，得100mg/L標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中密封保存。準(zhǔn)確量取儲(chǔ)備液，用甲醇∶水=1∶1稀釋定容，配制納他霉素的濃度梯度為0.1、0.5、1、2、5mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。并測(cè)定出最低檢出限。

1.2.4 樣品回收率實(shí)驗(yàn) 選用在空白樣品中添加那他霉素的濃度為0.25、1.0mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6次，測(cè)定果汁類產(chǎn)品的回收率。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)Table 1 Precision experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

飲料類樣品采用甲醇提取，由于納他霉素在甲醇中溶解度高，可以保證較好的提取效果。

2.2 超高效液相色譜條件的選擇

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)后，流動(dòng)相采用乙腈－20mmol乙酸銨。流速分別選取0.25、0.3、0.4mL/min，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流速的影響很小，最后確定0.3mL/min的流速，這樣柱壓不會(huì)過高，同時(shí)也避免因流速過低而產(chǎn)生的擴(kuò)散現(xiàn)象。

選取柱溫分別為25、30、35、40℃的條件下，隨著溫度的升高，保留時(shí)間不斷前移，最后選擇35℃的柱溫，在此溫度下，納他霉素色譜峰保留時(shí)間穩(wěn)定，不會(huì)造成因保留時(shí)間漂移而導(dǎo)致連續(xù)進(jìn)樣中產(chǎn)生一系列的無效數(shù)據(jù)。

綜上所述，超高效液相色譜操作條件確定為:流速:0.3mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣體積:10μL;流動(dòng)相: A為20mmol/L乙酸銨溶液，B為乙腈;流動(dòng)相比例為A∶B=75∶25等度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng):303nm。納他霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖如圖1所示。

圖1 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of natamycin standard

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、線性范圍及最低檢出限

納他霉素的濃度為0.1、0.5、1、2、5mg/L，以峰面積分值(Y)為縱坐標(biāo)，納他霉素溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.66 ×105X－2.39×104(R2=0.999)，線性范圍為0.25～5mg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖2所示。

稱取一定量果汁溶液，加入納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度含量為0.33、0.95、5.00mg/kg三個(gè)不同濃度樣品溶液，按照色譜條件，水平重復(fù)8次，以S/N≥10計(jì)的測(cè)定最低檢出限可以達(dá)到0.25mg/kg和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～0.4%;實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve

2.4 樣品回收率實(shí)驗(yàn)

選用在空白樣品中添加那他霉素的濃度為0.25、1.0mg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6次，測(cè)定果汁類產(chǎn)品的平均回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表2所示，樣品加標(biāo)譜圖見圖3。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 2 Recovery rate experiment(n=6)

圖3 樣品加標(biāo)液相色譜圖Fig.3 UPLC chromatogram of the simple adding standard

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相檢測(cè)果汁類樣品中納他霉素含量的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)單快捷，便于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性好。

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Determination of natamycin in various drinks by ultra performance liquid chromatography

ZHANG Hui1，WU Ying1，*，ZHU Lei1，LU Yong2，ZHANG Wei－min2，JIANG Jie2
(1.Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute，Beijing 100026，China; 2.Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring，Beijing 100041，China)

A method for the determination of natamycin in various drink was established by ultra performance liquid chromatography.The sample was extracted with methanol as extraction solvents.The analyte was determined by UPLC and quantified by the external standard curve.The separation was performed on a BEH Shield RP18 column by isocratic elution with a system of water(containing 20mmol/L ammonium acetate buffer)－acetonitrile as mobile phase.The method was simple，accurate and suitable for the identification and quantification.

ultra performance liquid chromatography;natamycin;determination

TS207.3

A

1002－0306(2012)08－0086－03

納他霉素(natamycin)又稱作游霉素、匹馬菌素、匹馬利星，它是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑，其抗菌機(jī)理是與細(xì)胞膜上的甾醇化合物反應(yīng)，破壞微生物細(xì)胞膜的架構(gòu)或改變細(xì)胞膜的滲透性，使微生物體內(nèi)的酶類和代謝產(chǎn)物溢出細(xì)胞外，導(dǎo)致微生物正常的生理平衡被破壞而失活［1］。納他霉素對(duì)大部分霉菌、酵母菌和真菌都有高度抑制作用，此外，由于納他霉素是白色、無氣味、無味道的粉末狀，對(duì)食品的口感和風(fēng)味沒有影響，常作為防腐劑使用，應(yīng)用于各類飲料中。目前報(bào)道的關(guān)于納他霉素的檢測(cè)方法有生物檢測(cè)法［2］、紫外分光光度法［3］、高效液相色譜法［4－5］、超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜［6］。目前應(yīng)用最多的是液相色譜法，生物檢測(cè)法和紫外分光光度法不能排除基質(zhì)干擾，難以精確定量，應(yīng)用范圍窄。超高效液相色譜作為液相色譜法的一種，具有超高分離度、超高速度、高靈敏度等特點(diǎn)［7］，用于納他霉素的檢測(cè)研究較少，此方法的開發(fā)可大大減少樣品分析時(shí)間。

2011－08－17 *通訊聯(lián)系人

張慧(1981－)，女，助工，研究方向:分析檢測(cè)。