高建明 Erle S.Robertson▲

1.三峽大學醫(yī)學院病理生理學教研室，湖北宜昌443002；2.美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院微生物學教研室，賓夕法尼亞費城19104

卡潑肉瘤病毒復制轉錄激活因子調控宿主細胞Bcl-2表達的分子機制及其生物學意義

高建明1Erle S.Robertson2▲

1.三峽大學醫(yī)學院病理生理學教研室，湖北宜昌443002；2.美國賓夕法尼亞大學醫(yī)學院微生物學教研室，賓夕法尼亞費城19104

目的研究卡潑肉瘤病毒（Kaposis′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）編碼的復制轉錄激活因子（replica tion and transcription activator，RTA）調控宿主細胞Bcl-2表達的分子機制及其生物學意義。方法突變Bcl-2啟動子第1個與第2個CCN9GG樣序列，構建了新的報告質粒（命名為pGL3-△RRE1,2），用熒光素酶試驗和染色質免疫共沉淀進一步驗證CCN9GG樣RTA反應元件的功能。構建RNA干擾慢病毒載體，篩選穩(wěn)定感染的BC3細胞，佛波酯誘導48 h后，分別用PCR、PI（碘化吡啶）染色流式細胞術檢測病毒子DNA和細胞凋亡率。結果突變第1個與第2個CCN9GG序列導致啟動子活性顯著降低；染色質免疫共沉淀試驗證實RTA蛋白與CCN9GG序列存在直接相互作用。用RNA干擾技術抑制Bcl-2基因后，佛波酯誘導的KSHV陽性細胞與對照組細胞相比凋亡率增加，病毒子產生減少。結論KSHV RTA能夠調控內源性細胞凋亡信號通路，延緩溶解性感染宿主細胞的凋亡，并促進病毒子產生。

復制轉錄激活因子；Bcl-2；表達上調；抗凋亡；溶解性感染

卡波肉瘤病毒（Kaposis's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）復制轉錄激活因子（replication andtranscriptionactivator，RTA）是ORF50編碼的一種即刻早期蛋白，是促使病毒從潛伏性感染向裂解性感染轉變的關鍵調控因子。無論是外源性還是內源性來源引起的RTA表達增高，均可介導病毒裂解性基因的級聯(lián)表達[1]。RTA主要通過兩種方式激活下游靶基因：一是直接與高親和性的RTA反應元件（RTA responsive elements，RREs）結合[2]；二是間接地與細胞內的一些轉錄因子結合發(fā)揮調控作用，這些轉錄因子包括K-RBP[3]、CEBP-α[4]、Oct-1[5]和RBP-JК[6]等。RREs主要有兩類，一類富含AT堿基，另一類含有CCN9GG樣序列，這里N可以為任何堿基。例如，KSHV ORF57基因啟動子含有這兩類RREs[2]。Bcl-2蛋白是一種定位于線粒體上的膜蛋白，為Bcl-2原癌基因所編碼，具有抑制細胞凋亡的功能[7-8]。本研究探討KSHV RTA調控Bcl-2的分子機制及其在宿主細胞增殖與凋亡、病毒子的產生等方面的生物學意義。

1 材料與方法

1.1 質粒

pcDNA-RTA編碼全長RTA的真核表達載體。pGL3-Bcl-2為含Bcl-2基因全長啟動子的熒光素酶報告質粒。pGL3-△P1是采用PCR定點突變技術構建的突變了Bcl-2基因P1啟動子的報告質粒，構建方法如下：先將啟動子片段（-346～+1）插入pGL3載體MluⅠ/HindⅢ雙酶切位點處（pGL3-P2），再將片段（核苷酸-2 867～-1 545）插入pGL3-P2的MluⅠ/HindⅢ雙酶切位點處。pGL3-△RRE1、2是在pGL3-△P1基礎上突變了第1個和第2個CCN9GG RRE的報告質粒，克隆所用引物見表1。

1.2 抗體與細胞

RTA抗體由上海巴斯德研究所藍柯實驗室惠贈。Bcl-2小鼠單克隆抗體購自Santa Cruz公司，GAPDH抗體購自Novus Biologicals公司，偶聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗購自Rockland公司。HEK 293是原代人胚腎細胞轉染腺病毒DNA的永生化細胞。BJAB為KSHV、EBVA均陰性的B細胞淋巴瘤細胞，BC3和BCBL1是感染KSHV的人體腔淋巴瘤細胞系。

1.3 細胞轉染及KSHV的誘導

采用Bio-Rad公司的Gene Pulser電穿孔儀進行細胞轉染。用20 ng/mL佛波酯、1.5 mmol/L丁酸鈉誘導KSHV。所有細胞均在誘導后培養(yǎng)48 h收集。

表1 PCR擴增及報告質粒構建的引物序列

1.4 Western blot

細胞收集后加入RIPA緩沖液裂解，用Bradford比色法測定蛋白質濃度。取相同質量的細胞裂解液上樣，聚丙烯胺凝膠電泳結束后，轉移蛋白樣品至PVDF膜，用Bcl-2抗體、RTA抗體、GAPDH抗體及偶聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗進行免疫印跡。用Odyssey紅外線成像系統(tǒng)（LI-COR公司）觀察結果。

1.5 熒光素酶報告基因試驗

107個HEK 293細胞共轉染10 μg熒光素酶報告質粒和10 μg RTA表達質粒。轉染后24 h收獲細胞，制備細胞裂解液。向40 μL細胞裂解液中加入25 μL熒光素酶試驗底物，使用LMaxII384熒光光度計（Molecular Devices）檢測熒光水平。結果以3次試驗值的均數(shù)與標準差表示。Western blot用來驗證轉染的蛋白質的表達。

1.6 染色質免疫共沉淀（ChIP）

BCBL1細胞于佛波酯誘導48 h后向培養(yǎng)液中加入甲醛，終濃度為1%，37℃固定細胞10 min，使蛋白質和DNA發(fā)生交聯(lián)。加入甘氨酸使其終濃度為0.125 mol/L，在室溫下晃動孵育5 min以終止交聯(lián)反應。使用預冷的PBS清洗細胞2次，加入含1%SDS的裂解液裂解細胞，超聲裂解細胞懸液將DNA均一地打斷成500～1 000 bp的片段。用ChIP稀釋緩沖液將超聲剪切后的DNA稀釋10倍，取20 μL稀釋液保存，這時的樣品標記為INPUT，作為PCR的空白對照。其余稀釋液加入蛋白A瓊脂糖磁珠，4℃孵2 h，分為兩組，一組加入RTA抗體，4℃振蕩過夜，另一組加入鼠IgG抗體作為陰性對照。將免疫復合物用磁珠沉淀，將沉淀物分別經低鹽、高鹽和氯化鋰溶液3次系列沖洗，然后用TE緩沖液洗2次，每次沖洗時間5 min。用新配制的洗脫緩沖液將蛋白/DNA復合物從磁珠上洗脫，加氯化鈉（Na+濃度為200 mmol/L）與2 μL RNaseA（0.5 mg/mL），65℃過夜，松解蛋白/DNA交聯(lián)；加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），于55℃水浴2 h。用酚/氯仿抽提DNA。以回收DNA片段為模板，進行PCR反應，DNA的數(shù)量水平可通過定量PCR來檢測，引物見表1。擴增產物越過RRE1與EERE2區(qū)域，片段長度為200 bp。同時做RT-PCR，用比較ΔΔCt值的方法對DNA豐度進行相對定量。

1.7 RNA干擾慢病毒載體的構建及細胞轉導

Bcl-2基因小片段發(fā)卡結構RNA（small hairpin RNA，shRNA）用shBcl-2表示；對照shRNA以shC表示。它們均由Sigma公司合成[9]。pGIPZ是一種shRNA慢病毒載體，用來表達Bcl-2小片段發(fā)卡結構RNA，購自Open Biosystems。RNA干擾慢病毒載體構建及細胞轉導實驗方法參見文獻[10]。本研究中，筆者構建了BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2細胞及其對照BC3-shC、BJAB-shC細胞。

1.8 病毒子DNA的PCR擴增

BC3-shBcl-2、BC3-shC細胞經佛波酯誘導后培養(yǎng)48 h，離心棄細胞，用0.45 μm孔徑的過濾器收集培養(yǎng)液上清，23 500 r/min離心20 min以沉淀病毒顆粒。加50 μL 0.2×PBS重懸病毒顆粒，放置95℃下15 min，加入1 μL蛋白酶K（10 mg/mL）于56℃孵育1 h，95℃30 min滅活蛋白酶K。取5 μL病毒裂解液作模板，PCR擴增KSHV編碼的K9。K9引物見表1。以BC3細胞中分離的KSHV基因組DNA為對照。PCR產物條帶的灰度用Kodak1D3.6軟件（Eastman）定量。

1.9 細胞凋亡檢測

PI染色流式細胞儀檢測細胞凋亡的原理是：凋亡細胞染色體降解、DNA碎片形成與可染性降低。收集細胞（106/mL）以1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。3 mL PBS洗滌1次。離心去PBS，加入冰預冷的70%乙醇固定，4℃過夜。離心棄去固定液，PBS重懸細胞。加入終濃度50 μg/mL PI（Sigma公司）、1 μg/mL RNA酶于4℃下避光染色1 h。用FACSCalibur流式細胞儀（Becton Dickinson公司）檢測細胞凋亡，每個樣本重復測定6次。

1.10 統(tǒng)計學方法

數(shù)據分析采用FlowJo軟件（Tree Star），采用方差分析進行統(tǒng)計學檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 突變第1個與第2個CCN9GG RRE導致啟動子活性顯著降低

為進一步驗證CCN9GG RRE的功能，筆者將pGL3-△P1報告質粒中的第1個和第2個CCN9GG RRE進行了突變，得到了pGL3-△RRE1、2這一新的報告質粒（圖1A）。熒光素酶試驗結果表明突變第1個與第2個CCN9GG RRE導致啟動子活性顯著降低（圖1B）。在沒有轉染RTA的293細胞，報告質粒pGL3-△RRE1、2的熒光素酶活性與對照質粒pGL3-Basic都比較低；在轉染了RTA的293細胞，報告質粒pGL3-△RRE1、2的熒光素酶活性約增加10倍，約為帶有9個完整CCN9GG RRE的pGL3-△P1報告質粒熒光素酶活性的1/3。預留部分細胞裂解液做Western blot檢測，以GAPDH作為對照，轉染細胞RTA表達良好，表明轉染效率佳。

2.2 RTA蛋白與CCN9GG序列存在直接相互作用

用佛波酯誘導和未經誘導的BCBL1細胞進行ChIP試驗，表明RTA蛋白與CCN9GG序列存在直接的相互作用。PCR擴增證實免疫復合物中存在跨越第1個和第2個CCN9GG序列的DNA片段。在RTA抗體沉淀下來的經誘導的核DNA組目的條帶清晰可見，在RTA抗體沉淀下來的未經誘導的核DNA組無陽性信號，兩個IgG抗體陰性對照組亦均無陽性條帶（圖2A）。實時PCR用來相對定量沉淀下來的DNA的豐度，RTA抗體沉淀下來的經誘導BCBL1細胞的核DNA量比對照組高8～32倍（圖2B）。

2.3 RTA介導的Bcl-2上調延緩溶解性感染的宿主細胞的凋亡，促進病毒子產生

RTA上調Bcl-2表達，Bcl-2是調節(jié)細胞凋亡的重要分子，因此筆者推測RTA介導的Bcl-2上調具有抑制宿主細胞的凋亡、促進病毒子產生的生物學功能。為驗證此假設，筆者應用慢病毒介導的RNA干擾技術構建了Bcl-2抑制的穩(wěn)定細胞株（BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2）及對照細胞株（BC3-shC、B JAB-shC）。Western blot分析證實BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2細胞的Bcl-2蛋白的表達水平很低（圖3A）。BC3-shBcl-2、BC3-shC細胞經佛波酯誘導后培養(yǎng)48 h，分離宿主細胞裂解產生的病毒子，以PBS重懸的病毒顆粒作模板，擴增KSHV編碼的K9基因。結果顯示Bcl-2抑制細胞病毒子的產量約為對照組細胞的1/2（圖3B）。這表明RTA介導的Bcl-2表達上調能夠促進宿主細胞病毒子的產生。流式細胞儀分析顯示KSHV陰性細胞BJAB-shC與BJAB-shBcl-2細胞經佛波酯誘導后細胞凋亡率分別為62.4%、64.4%，二者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；KSHV陽性細胞BC3-shC與BC3-shBcl-2細胞經佛波酯誘導后細胞凋亡率分別為58.2%、71.5%（圖3C），二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

Bcl-2家族成員調控著內源性線粒體途徑的細胞凋亡[11]。其中根據其結構和功能可將Bcl-2家族成員分為兩類，一類是具有抗凋亡功能，如：Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL等，它們含有4個高度保守的Bcl-2同源結構域（BH 1-4）[12]；另一類具有促進凋亡的功能，如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim等，其中Bax、Bak含有BH 1-3，而Bid、Bad、Bim等僅含BH3結構[13]。BH3是與促進凋亡有關的結構域，BH4是抗凋亡蛋白所特有的結構域。Bcl-2蛋白為Bcl-2原癌基因所編碼，不論在生理或病理條件下均具有抑制細胞凋亡的功能[7-8]。Bcl-2基因在許多腫瘤細胞都高表達，不僅阻止腫瘤細胞凋亡，而且是腫瘤化療、放療不敏感的重要原因[14-15]。

筆者前期研究[16]發(fā)現(xiàn)KSHV RTA能夠上調宿主細胞Bcl-2表達。RTA可直接激活Bcl-2基因啟動子，這種激活作用呈劑量依賴性，無細胞選擇性。CCN9GG RREs和P2啟動子對RTA調控Bcl-2表達具有重要作用。為進一步驗證CCN9GG樣RTA反應元件的功能，闡明RTA調控Bcl-2的分子機制及其生物學意義，筆者突變Bcl-2啟動子第1個和第2個CCN9GG RRE，在pGL3-△P1基礎上構建了pGL3-△RRE1、2這一新的報告質粒。熒光素酶試驗結果顯示，突變第1個與第2個CCN9GG RRE導致RTA介導的Bcl-2啟動子活性顯著降低。染色質免疫共沉淀實驗表明RTA蛋白與Bcl-2啟動子中的RREs存在直接的相互作用。上述證據再次證明CCN9GG RRE對RTA反式激活Bcl-2具有重要的作用。用RNA干擾技術抑制Bcl-2基因后，佛波酯誘導的BC3-shB-cl2細胞與對照組細胞相比凋亡率顯著增加，病毒子產生減少。

綜上所述，KSHV RTA介導的Bcl-2表達上調促進病毒的溶解性感染，可以延緩宿主細胞的凋亡，并增加病毒子的產生。

[志謝：衷心感謝Véronique Bourgarel-Rey（Aix-Marseille Université，Marseille Cedex 05，F(xiàn)rance）提供Bcl-2基因全長啟動子熒光素酶報告質粒pGL3-Bcl-2。]

[1]Lukac DM，Kirshner JR，Ganem D.Transcriptional activation by the product of open reading frame 50 of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus is required for lytic viral reactivation in B cells[J].J Virol，1999，73（11）：9348-9361.

[2]Wen HJ，Minhas V，Wood C.Identification and characterization of a new Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus replication and transcription activator（RTA）-responsive element involved in RTA-mediated transactivation[J].J Gen Virol，2009，90（Pt4）：944-953.

[3]Yang Z，Wood C.The transcriptional repressor K-RBP modulates RTA-mediated transactivation and lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus[J].J Virol，2007，81（12）：6294-6306.

[4]Wang SE，Wu FY，F(xiàn)ujimuro M，et al.Role of CCAAT/enhancer-binding protein alpha（C/EBPalpha）in activation of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）lytic-cycle replication-associated protein（RAP）promoter in cooperation with the KSHV replication and transcription activator（RTA）and RAP[J].J Virol，2003，77（1）：600-623.

[5]Sakakibara S，Ueda K，Chen J，et al.Octamer-binding sequence is a key element for the autoregulation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF50/Lyta gene expression[J].J Virol，2001，75（15）：6894-6900.

[6]Liang Y，Ganem D.RBP-J（CSL）is essential for activation of the K14/ vGPCR promoter of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus by the lytic switch protein RTA[J].J Virol，2004，78（13）：6818-6826.

[7]Bourgarel-Rey V，Savry A，Hua G，et al.Transcriptional down-regulation of Bcl-2 by vinorelbine：identification of a novel binding site of p53 on Bcl-2 promoter[J].Biochem Pharmacol，2009，78（9）：1148-1156.

[8]Onyshchenko MI，Gaynutdinov TI，Englund EA，et al.Stabilization of G-quadruplex in the BCL2 promoter region in double-stranded DNA by invading short PNAs[J].Nucleic Acids Res，2009，37（22）：7570-7580.

[9]Junn HJ，Kim JY，Seol DW.Effective knockdown of multiple target genes by expressing the single transcript harbouring multi-cistronic shRNAs[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，396（4）：861-865.

[10]Lu J，Verma SC，Murakami M，et al.Latency-associated nuclear antigen of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）upregulates survivin expression in KSHV-Associated B-lymphoma cells and contributes to their proliferation[J].J Virol，2009，83（14）：7129-7141.

[11]FlanaganAM，LetaiA.BH3domainsdefineselectiveinhibitoryinteractions with BHRF-1 and KSHV BCL-2[J].Cell Death Differ，2008，15（3）：580-588.

[12]Chipuk JE，Moldoveanu T，Llambi F，et al.The BCL-2 family reunion [J].Mol Cell，2010，37（3）：299-310.

[13]Cory S，Adam JM.The Bcl2 family：regulators of the cellular life-ordeath switch[J].Nat Rev Cancer，2002，2（9）：647-656.

[14]Ohmori T，Podack E，Nishio K，et al.Apoptosis of lung cancer cells caused by some anti-cancer agents（MMC，CPT-11，ADM）is inhibited by bcl-2[J].Biochem Biophys Res Commun，1993，192（1）：30-36.

[15]Harima Y，Harima K，Shikata N，et al.Bax and Bcl-2 expressions predict response to radiotherapy in human cervical cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，1998，124（9）：503-510.

[16]高建明，Erle S.Robertson.KSHV RTA上調宿主細胞Bcl-2表達的分子機制研究[J].中國當代醫(yī)藥，2012，19（30）：12-15.

Molecular mechanism and biological significance of upregulation of cellular Bcl-2 by the KSHV encoded RTA

GAO Jianming1Erle S.Robertson2▲
1.Department of Pathophysiology,Three Gorges University School of Medicine,Hubei Province,Yichang443002,China; 2.Department of Microbiology,University of Pennsylvania School of Medicine,Philadelphia,Pennsylvania19104，United States of American

Objective To explore the molecular mechanism and biological significance of upregulation of cellular Bcl-2 by the KSHV(Kaposis's sarcoma-associated herpesvirus)encoded RTA(replication and transcription activator).Methods A new reporter plasmid named pGL3-△RRE1,2 was generated by deletion of the first and second CCN9GG-like sequences. Luciferase assay and chromatin immunoprecipitation(ChIP)analysis were carried out to further confirm the important role of CCN9GG RTA responsive elements(RREs).RNA interference lentiviral vector was constructed,and stablly infected BC3 cells were screened.At 48 h postinduction,cells were subjected to PCR,PI staining flow cytometry for virus progeny production and cellular apoptosis analysis.Results Mutation of the first and second CCN9GG RRE motifs I the Bcl-2 promoter dramatically diminished promoter activity.ChIP assay showed the direct interaction of RTA protein with CCN9GG RTA responsive elements.Furthermore,knockdown of cellular Bcl-2 using specific short hairpin RNA(shRNA)indicated that RTA plays an essential role in Bcl-2-mediated anti-apoptosis of the cell,promoting the production of virus progeny. Conclusion These findings provide an insight into the mechanism by which KSHV utilizes the intrinsic apoptosis signaling pathways for promoting the survival of lytically infected host cells to allow maximum production of virus progeny.

RTA;Bcl-2;Upregulation;Antiapoptosis;Lytic replication

R373

A

1673-7210（2012）11（a）-0012-04

2012-09-06本文編輯：谷俊英）

National Cancer Institute 5R01CA091792-08，5R01CA108461-05，1R01CA137894-01 and 1R01CA138434-01A209;National Institute of Allergy and Infectious Diseases 5R01AI067037-04 and National Institute of Dental and Craniofacial Research 5R01DE017338-03（to ESR）.

▲通訊作者