馮偉華 常艷璐▲

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古呼和浩特010059；2.北京天壇醫(yī)院藥劑科，北京100050

長(zhǎng)雙歧桿菌液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

馮偉華1常艷璐2▲

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古呼和浩特010059；2.北京天壇醫(yī)院藥劑科，北京100050

目的優(yōu)化長(zhǎng)雙歧桿菌的液態(tài)發(fā)酵條件。方法通過(guò)單因素試驗(yàn)方法，考察長(zhǎng)雙歧桿菌液態(tài)培養(yǎng)基的最佳初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量和培養(yǎng)時(shí)間。結(jié)果長(zhǎng)雙歧桿菌的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵液初始pH 7.0、發(fā)酵培養(yǎng)溫度39℃、發(fā)酵接種量6%、最佳培養(yǎng)時(shí)間8～10 h。結(jié)論本課題研究確定的發(fā)酵工藝有效地提高了長(zhǎng)雙歧桿菌的培養(yǎng)效率。

長(zhǎng)雙歧桿菌；發(fā)酵條件的優(yōu)化；生長(zhǎng)曲線

雙歧桿菌（bifidobacterium longum）是人體消化道內(nèi)具有益生作用的優(yōu)勢(shì)菌群，其具有的生理功能包括：調(diào)整腸道菌群[1-2]，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[3]，防止便秘，治療潰瘍性結(jié)腸炎[4-5]，產(chǎn)生抗生素，提高蛋白質(zhì)和維生素的代謝，抗衰老，治療肝損傷，抗腫瘤，降低膽固醇等[6]。雙歧桿菌對(duì)機(jī)體生理功能的重要作用，促使了含雙歧桿菌的食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)以長(zhǎng)雙歧桿菌為發(fā)酵菌株，以TPY改良培養(yǎng)基[7]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件（培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量）的考察，確定了長(zhǎng)雙歧桿菌的最佳培養(yǎng)條件；通過(guò)對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，確定了長(zhǎng)雙歧桿菌的最佳發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)也驗(yàn)證了該菌的發(fā)酵工藝。

1 儀器與試藥

1.1 試劑與菌種

長(zhǎng)雙歧桿菌：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。氮源：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Primo Star顯微鏡：德國(guó)卡爾蔡司公司（Zeiss）；Moticam 2306顯微攝影儀：Moticam公司；垂直層流潔凈工作臺(tái)CA-1390-1：上海上凈凈化設(shè)備有限公司；LDZX-40SBI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基

TPY液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、酪蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉蛋白胨1%、水解乳蛋白2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨0.2%、吐溫-80 0.1%、MgSO40.05%、MnSO40.02%、K2HPO40.05%。用5%的NaOH調(diào)節(jié)pH為6.8。培養(yǎng)基121℃滅菌30min，至4℃冰箱保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 發(fā)酵液活菌數(shù)的檢測(cè)

采用平板混菌計(jì)數(shù)法，即將發(fā)酵液菌濃度逐級(jí)稀釋至10-6倍、10-7倍、10-8倍，然后吸取1 mL稀釋液加入到滅菌的空白平皿中，每個(gè)樣平行做3塊平皿，再倒入50～55℃的TPY培養(yǎng)基15～20 mL，搖勻，待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置放于38℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法

液體發(fā)酵培養(yǎng)采取三級(jí)培養(yǎng)的方法，一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基，其作用是活化菌種，并起到擴(kuò)大培養(yǎng)的作用，三級(jí)為發(fā)酵培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)每級(jí)分裝50 mL培養(yǎng)液到100 mL三角瓶中，放置厭氧培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)12 h。接種過(guò)程為：由凍干菌種接入一級(jí)種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后按5%的接種量接入二級(jí)種子培養(yǎng)基，二級(jí)培養(yǎng)12 h后，按5%的接種量接入三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后為發(fā)酵終點(diǎn)。

2.2.2 發(fā)酵液初始pH的優(yōu)化

按配方配制好培養(yǎng)基后，用5%的NaOH或5%乙酸調(diào)節(jié)pH，按表1調(diào)節(jié)不同的pH，其中5號(hào)為原對(duì)照。

表1 發(fā)酵液初始pH

2.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

按配方配制好培養(yǎng)基后，調(diào)節(jié)厭氧培養(yǎng)箱的溫度，按表2考查不同的培養(yǎng)溫度，其中3號(hào)為原對(duì)照。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)溫度表

2.2.4 發(fā)酵接種量?jī)?yōu)化

按配方配制好培養(yǎng)基后，考查一級(jí)到二級(jí)，二級(jí)到三級(jí)的接種量，按表3選取考查不同的接種量，其中3號(hào)為原對(duì)照。

表3 發(fā)酵接種量表

2.3 發(fā)酵生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

按配方配制好培養(yǎng)基后，連續(xù)接入13瓶相同的三級(jí)培養(yǎng)基，放入?yún)捬跸渑囵B(yǎng)，按表4所示的不同時(shí)間點(diǎn)取出后檢測(cè)活菌數(shù)。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

2.4.1.1 發(fā)酵液初始pH的優(yōu)化調(diào)節(jié)不同的pH后，發(fā)酵液活菌數(shù)有較大的變化，見(jiàn)表5。

由表5可知，6號(hào)發(fā)酵液活菌數(shù)均值最高，因此確定培養(yǎng)基最佳初始pH值為7.0。

2.4.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)溫度的優(yōu)化依據(jù)上步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將培養(yǎng)基初始pH調(diào)節(jié)為7.0，設(shè)定不同的培養(yǎng)溫度后，發(fā)酵液活菌數(shù)有較大的變化，見(jiàn)表6。

由表6可知，5號(hào)發(fā)酵液活菌數(shù)均值最高，因此確定最佳培養(yǎng)溫度為39℃。

2.4.1.3 發(fā)酵接種量?jī)?yōu)化結(jié)果依據(jù)上步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將培養(yǎng)基初始pH調(diào)節(jié)為7.0，將培養(yǎng)溫度設(shè)定為39℃，接入不同量的種子培養(yǎng)基后，發(fā)酵液活菌數(shù)有較大的變化，見(jiàn)表7。

由表7可知，4號(hào)發(fā)酵液活菌數(shù)均值最高，因此確定培養(yǎng)基最佳接種量為6%。

2.5 發(fā)酵生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

依據(jù)上步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)為7.0，將培養(yǎng)溫度設(shè)定為39℃，培養(yǎng)基接種量為6%，放入?yún)捬跸渑囵B(yǎng)，間隔1 h取樣測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù)，見(jiàn)表8。

由圖1可以看出，0～1 h是菌體的適應(yīng)期，2～7 h是菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8～10 h是菌體的穩(wěn)定生長(zhǎng)期，10 h以后菌體進(jìn)入衰亡期，且8～10 h菌體活菌數(shù)相對(duì)其他時(shí)間段最高，因此確定8～10 h為發(fā)酵培養(yǎng)的最佳時(shí)間。

綜上，通過(guò)對(duì)發(fā)酵液不同初始pH（6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0）的考察，最終確定發(fā)酵液最佳初始pH為7.0。通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵培養(yǎng)溫度（35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃）的考察，最終確定發(fā)酵最佳培養(yǎng)溫度為39℃。通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵接種量（3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%）的考察，最終確定發(fā)酵最佳接種量為6%。通過(guò)對(duì)發(fā)酵生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，最終確定最佳培養(yǎng)時(shí)間為8～10 h。通過(guò)對(duì)發(fā)酵液初始pH、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、發(fā)酵接種量的考察，以及對(duì)發(fā)酵生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，最終確定長(zhǎng)雙歧桿菌的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵液初始pH 7.0、發(fā)酵培養(yǎng)溫度39℃、發(fā)酵接種量6%、最佳培養(yǎng)時(shí)間8～10 h。發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)到2.663×109cfu/mL，大大地提高了長(zhǎng)雙歧桿菌的培養(yǎng)效率。

表4 發(fā)酵生長(zhǎng)曲線測(cè)定時(shí)間

表5 發(fā)酵液初始pH優(yōu)化結(jié)果

表6 發(fā)酵培養(yǎng)溫度優(yōu)化結(jié)果

表7 發(fā)酵接種量?jī)?yōu)化結(jié)果

表8 發(fā)酵生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

3 討論

在發(fā)酵條件優(yōu)化過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)較低的初始pH會(huì)造成菌體初期生長(zhǎng)過(guò)快，而縮短了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)，pH太高會(huì)造成菌體生長(zhǎng)太慢，發(fā)酵液活菌數(shù)不高。在考察不同的培養(yǎng)溫度時(shí)，溫度太低或太高都不利于菌體的生長(zhǎng)，溫度調(diào)節(jié)為39℃菌體生長(zhǎng)較快，且發(fā)酵液活菌數(shù)較高，可能由于此溫度是菌體內(nèi)大多數(shù)酶的最佳作用溫度。在考察不同的接種量時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)接種量太低菌體生長(zhǎng)過(guò)慢，菌體的適應(yīng)期延長(zhǎng)，造成菌體生長(zhǎng)狀況不好；而接種量太高時(shí)菌體生長(zhǎng)過(guò)快，以至于菌體較早進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用太快，從而限制了菌體的進(jìn)一步生長(zhǎng)。

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The optimization of lipuid fermentation conditions and the determination of growth curve for bifidobacterium longum

FENG Weihua1CHANG Yanlu2▲
1.Department of Pharmacy,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Hohhot010059,China;2.Department of Pharmacy,Beijing Tiantan Hospital,Beijing100050,China

Objective To optimize the fermentation conditions for bifidobacterium longum.Methods By the single-factor test,the best initial pH,incubation temperature,inoculum size and incubation time of the culture medium for bifidobacterium longum were investigated.Results The optimal fermentation conditions of bifidobacterium longum were as follow:the initial pH of fermentation broth was 7.0,the fermentation temperature was 39℃,the fermentation inoculation size was 6%, the best incubation time was 8-10 h.Conclusion This fermentation technology effectively improves the efficiency of the cultivation of bifidobacterium longum.

Bifidobacterium longum;Optimization of fermentation conditions;Growth curve

TQ925

A

1673-7210（2012）11（a）-0115-03

2012-06-15本文編輯：衛(wèi)軻）

▲通訊作者