王明麗， 李 智， 徐晉豫， 翁文浩， 許閃閃

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200072)

m iR-34a通過調(diào)控YY1抑制腎癌細(xì)胞的增殖及侵襲

王明麗， 李 智， 徐晉豫， 翁文浩， 許閃閃

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200072)

目的 探討miR-34a在腎癌組織中表達(dá)、miR-34a對(duì)人腎癌ACHN細(xì)胞增殖和侵襲的影響及調(diào)控機(jī)制。方法 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)miR-34a在20例腎癌及癌旁組織中的表達(dá);采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-34amimics轉(zhuǎn)染入腎癌ACHN細(xì)胞中，試驗(yàn)分空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-34amimics轉(zhuǎn)染組。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染24 h后miR-34a表達(dá)量;噻唑藍(lán)(MTT)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期;Transwell及Matrigel檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力;實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)錄因子YY1表達(dá)水平。結(jié)果 與癌旁組織相比，20例癌組織中miR-34a平均表達(dá)量為1．06±0．67，顯著低于癌旁組織(1．62±0．83，P＜0．01);轉(zhuǎn)染后24 h，miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組的 miR-34a表達(dá)量為157．04±13．01，較陰性對(duì)照組顯著上調(diào)(P＜0．01);miR-34amimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P＜0．01)，細(xì)胞生長被阻滯在G0/G1期;細(xì)胞侵襲能力明顯減弱(P＜0．01);轉(zhuǎn)染miR-34amimics后YY1基因在mRNA表達(dá)無明顯變化(P＞0．05)，蛋白水平下調(diào)。結(jié)論 miR-34a在腎癌中低表達(dá)，可能與腎癌的發(fā)生有關(guān);miR-34a調(diào)控YY1的表達(dá)可能是抑制腎癌細(xì)胞生物活性的重要機(jī)制之一。

miR-34a;YY1;細(xì)胞增殖;侵襲;腎癌

腎癌占成人惡性腫瘤的2% ～3%，其中以腎透明細(xì)胞癌最多見［1］。由于腎透明細(xì)胞癌對(duì)化療、放療均不敏感，免疫治療也難以取得理想效果，基因治療已成為研究的熱點(diǎn)。

microRNA是一種長約22個(gè)核苷酸的小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列 RNA。自2002年 Calin等［2］首次報(bào)道m(xù)icroRNA異常與腫瘤相關(guān)后，越來越多的研究顯示microRNA參于腫瘤細(xì)胞發(fā)育、分化、凋亡和增殖等的調(diào)控，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。miR-34a是一個(gè)進(jìn)化保守的microRNA家族miR-34中的一員，編碼基因位于染色體1p36。有文獻(xiàn)報(bào)道稱miR-34a在人類胰腺癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等眾多惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失［3-5］，并認(rèn)為其低表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。本研究觀察miR-34a在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，并使用miR-34a模擬物(miR-34a mimics)轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞株ACHN，觀察miR-34a對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。由于通過軟件預(yù)測(cè)得知轉(zhuǎn)錄因子YY1是miR-34a的靶基因，本研究進(jìn)一步分析了其對(duì)YY1的調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

一、材料

人腎癌細(xì)胞株 ACHN(ATCC號(hào):CRL-1611TM)由上海市第十人民醫(yī)院泌尿外科惠贈(zèng);DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自Hyclone公司和Gibco公司;逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自TAKARA公司;LiPofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和Trizol購自美國 Invitrogen公司;兔抗人YY1單克隆抗體購自Epitomics公司;人miR-34amimics、microRNA 陰性對(duì)照(miR Negative Control)由廣州銳博生物公司合成;實(shí)時(shí) PCR引物由上海生物工程有限公司合成，采用莖環(huán)法設(shè)計(jì)miR-34a和內(nèi)參U6 RNA的逆轉(zhuǎn)錄和PCR的引物;普通基因PCR以18S作為內(nèi)源性參照，見表1;Transwell小室購自BD公司;Matrigel購自Sigma公司。

二、腎癌標(biāo)本miR-34a表達(dá)水平檢測(cè)

標(biāo)本取自上海市第十人民醫(yī)院2008至2010年間手術(shù)切除的20例腎透明細(xì)胞癌及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，所有標(biāo)本于液氮凍存。Trizol裂解組織標(biāo)本，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得各標(biāo)本 cDNA。取2μL cDNA為模板，加入 18μL PCR反應(yīng)液［4μmol/L基因引物1μL，2×高靈敏DNA熒光染料(SYBR)Premix Ex Taq 10μL，紅色熒光染料ROX Dye(陽性參比信號(hào)，50×)0．4 μL，雙蒸水(ddH2O)6．6μL］。在 ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:95℃ 預(yù)變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40 個(gè)

循

環(huán)，72℃ 5 min。

表1 PCR引物序列、產(chǎn)物長度

三、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

ACHN細(xì)胞貼壁生長于DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前1天將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，于24 h內(nèi)當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)40% ～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用陽離子脂質(zhì)體 LiPofectamine 2000按試劑盒操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，試驗(yàn)分3組:空白對(duì)照組(只加脂質(zhì)體)、陰性對(duì)照組、miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組。

四、熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后miR-34a表達(dá)

Trizol提取各試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得各標(biāo)本cDNA。熒光定量PCR，以U6作為內(nèi)參，反應(yīng)條件同上。

五、細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

轉(zhuǎn)染5 h后消化細(xì)胞以1 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板上，每孔補(bǔ)足200μL培養(yǎng)基。各試驗(yàn)組每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染1、2、3和4 d后每孔加入20μL噻唑藍(lán)(MTT)，孵育4 h，吸棄原液加入150μL二甲基亞砜(DMSO)震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長處的吸光度(A)值，各組求均值做生長曲線。

六、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化

取至少105個(gè)轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，離心棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，1×Binding buffer重懸細(xì)胞，加入碘化丙錠(PI)5 μL，去 RNA 酶 1．25 μL，裂解液(NP40)0．25μL后檢測(cè)細(xì)胞周期。

七、細(xì)胞侵襲遷移能力檢測(cè)

1．Transwell遷移試驗(yàn) 轉(zhuǎn)染5 h后消化細(xì)胞，以含0．1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，5×104個(gè)/小室接種于Transwell上室中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至100μL，下室為500μL完全培養(yǎng)基，20 h后取出將上室內(nèi)面擦凈，乙醇固定，結(jié)晶紫染色，清洗，拍照。33%冰醋酸溶解細(xì)胞，酶標(biāo)儀檢測(cè)A573nm值。

2．Matrigel侵襲試驗(yàn) 50μL Matrigel包被Transwell小室，37℃ 1 h。轉(zhuǎn)染5 h后消化細(xì)胞，以含0．1%BSA的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，1×105個(gè)/小室接種于上室中，最終保持上室內(nèi)100μL培養(yǎng)基，24 h后，按Transwell試驗(yàn)進(jìn)行后續(xù)操作。

八、熒光定量 PCR、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè)YY1 mRNA及蛋白表達(dá)

Trizol提取各試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得各標(biāo)本cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以18S為內(nèi)參，反應(yīng)條件同上。轉(zhuǎn)染48 h后，抽提總蛋白，進(jìn)行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入兔抗人YY1抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，再加入IRye700×標(biāo)記的羊抗兔和IRye800×標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶1 000)孵育后，以β-actin為內(nèi)參，用ODYSSEY數(shù)字顯像系統(tǒng)采集信號(hào)。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17．0軟件包對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示，組織標(biāo)本結(jié)果經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較組間miR-34a水平的差異，單因素方差分析和q檢驗(yàn)做多組間及兩兩比較。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腎癌及癌旁組織標(biāo)本miR-34a表達(dá)情況

經(jīng)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增得到各目的基因的Ct值，以2-△△Ct相對(duì)定量的方法計(jì)算 miR-34a與 U6拷貝數(shù)的比值，數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后比較癌旁組和腎癌組之間的差異，20例腎癌組織標(biāo)本中miR-34a的表達(dá)量為 1．06±0．67，明顯低于癌旁組織(1．62 ±0．83)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6．87，P ＜0．01)。見圖 1。

二、轉(zhuǎn)染miR-34amimics后miR-34a表達(dá)變化

圖1 腎癌及癌旁組織miR-34a的表達(dá)

經(jīng)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增得到各目的基因的Ct值，以2-△△Ct相對(duì)定量的方法計(jì)算 miR-34a與 U6拷貝數(shù)的比值，比較試驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異，以陰性對(duì)照組miR-34a表達(dá)量為1，miR-34amicmics轉(zhuǎn)染組表達(dá)量為157．04±13．01，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20．768，P ＜0．01);而空白對(duì)照組為1．10±0．17，與陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1．01，P ＞0．05)。

三、細(xì)胞增殖能力的變化

細(xì)胞增殖曲線顯示，miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度明顯降低，轉(zhuǎn)染后1、2、3、4 d細(xì)胞生長抑制率［(1－AmiR-34a/A陰性對(duì)照)×100%］分別為9%、25%、37%和50%，以轉(zhuǎn)染后4 d最高，與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40．53，P＜0．01)，而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0．76，P ＞0．05)。見圖2。

圖2 miR-34amimics對(duì)ACHN細(xì)胞增殖的影響

四、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化

轉(zhuǎn)染miR-34amimics后，處于G0/G1期細(xì)胞數(shù)百分比增多，陰性對(duì)照組為 31．82±0．97，與miR-34a組(42．87±0．40)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18．19，P ＜0．01)，空白對(duì)照組為 33．94 ±1．62，與陰性對(duì)照組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1．95，P ＞0．05)。見圖3。

五、細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變

轉(zhuǎn)染 miR-34a mimics后，miR-34a組(0．08±0．004)的細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組(0．168±0．003)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26．2，P ＜0．01)?？瞻讓?duì)照組(0．63 ±0．005)與陰性對(duì)照組比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1．31，P＞0．05)。見圖4、5。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-34amimics對(duì)ACHN細(xì)胞周期的影響

圖4 轉(zhuǎn)染miR-34amimics對(duì)ACHN細(xì)胞遷移能力的影響(200×)

圖5 冰醋酸溶解后細(xì)胞A值

轉(zhuǎn)染 miR-34amimics后，miR-34a組(0．11 ±0．007)穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)較陰性對(duì)照組(0．18±0．005)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12．45，P ＜0．01)，空白對(duì)照組(0．17 ±0．005)與陰性對(duì)照組則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1．04，P ＞0．05)。見圖 6、7。

六、轉(zhuǎn)染后YY1 mRNA水平及蛋白水平變化

圖6 轉(zhuǎn)染miR-34amimics對(duì)ACHN細(xì)胞侵襲能力的影響(200×)

圖7 冰醋酸溶解后細(xì)胞A值

經(jīng)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增得到各目的基因的Ct值，以2-△△Ct相對(duì)定量的方法計(jì)算各基因與18 S拷貝數(shù)的比值，比較試驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48 h后，YY1 mRNA水平無明顯變化，空白對(duì)照組為 1．22±0．089，與陰性對(duì)照組(1．0 ±0．015)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3．18，P＞0．05)。陰性對(duì)照組與 miR-34a組(0．96±0．043)相比差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0．98，P＞0．05)。Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 48 h 后，YY1蛋白表達(dá)水平明顯降低。見圖8、9。

圖8 轉(zhuǎn)染miR-34amimics后YY1 mRNA表達(dá)的變化

圖9 轉(zhuǎn)染miR-34amimics后YY1蛋白水平的變化

討 論

腎癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤，其治療以外科手術(shù)切除為主，但這給晚期腎癌的治療帶來一定的困難［1］。近年來對(duì)基因治療的應(yīng)用研究逐漸成為腎癌新療法的研究熱點(diǎn)。目前已有多種基因治療方案在臨床上得到初步應(yīng)用，同時(shí)研究人員仍在不斷找尋新的治療基因。而microRNA的發(fā)現(xiàn)無疑為腫瘤基因治療注入了新的活力。

microRNA通過抑制其靶基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、增殖、凋亡、耐藥以及轉(zhuǎn)移等方面均發(fā)揮著重要作用，有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。50%以上的microRNA編碼基因位于與癌癥有關(guān)的基因區(qū)或脆性位點(diǎn)內(nèi)。在多種類型腫瘤細(xì)胞系和腫瘤中均可以檢測(cè)到microRNA的異常表達(dá)。miR-34a的CPG島甲基化沉默在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胰腺癌等多種細(xì)胞系中存在［6］，這表明miR-34a的失活可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，提示其在上述腫瘤中發(fā)揮作用。目前對(duì)于miR-34a在腎癌細(xì)胞中的功能鮮有報(bào)道。因此，研究miR-34a在腎癌中的功能并進(jìn)一步探索其作用機(jī)制有重要意義。

miR-34a在腎癌中的表達(dá)如何?是否也參與腎癌的發(fā)生和發(fā)展?本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，miR-34a在腎癌中呈低表達(dá)，表明miR-34a的低表達(dá)可能在腎癌發(fā)生和發(fā)展中起一定作用。最新研究證明在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中miR-34a充當(dāng)著重要的抑癌基因的角色［7］。在腎癌中miR-34a是否也有著同樣重要的作用，本研究通過直接瞬時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA mimics對(duì)miR-34a功能進(jìn)行了檢測(cè)，該法的優(yōu)點(diǎn)在于化學(xué)合成microRNA簡單、快捷，可避免構(gòu)建表達(dá)載體的步驟，從而有效提高了特定microRNA的表達(dá)。本研究將miR-34amimics轉(zhuǎn)染入ACHN細(xì)胞內(nèi)，使miR-34a在腎癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖明顯受抑，這種抑制效應(yīng)在轉(zhuǎn)染后1～2 d顯現(xiàn)，并持續(xù)4 d以上，且細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，有絲分裂受到抑制，說明miR-34a在促進(jìn)細(xì)胞生長分化方面可能起重要作用。本研究結(jié)果還顯示，miR-34amimics轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞侵襲遷移能力明顯減弱，提示miR-34amimics抑制細(xì)胞侵襲能力。

我們通過 mirBase、TargetScan和 PicTar等生物信息學(xué)網(wǎng)站分析miR-34a可能的靶基因，且Chen等［8］已通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)YY1是miR-34a的直接靶基因，miR-34a直接與YY1的3'非編碼區(qū)結(jié)合來調(diào)控其翻譯。YY1具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移的作用，在前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌、骨肉瘤等腫瘤中都顯著高表達(dá)，揭示了YY1在腫瘤發(fā)展中的重要作用［9-10］。其在腎癌中的功能目前未見報(bào)道，本課題組前期工作證實(shí)了YY1在腎癌細(xì)胞中扮演癌基因的作用。利用Western blot技術(shù)，本研究檢測(cè)出轉(zhuǎn)染miR-34amimics后ACHN細(xì)胞YY1蛋白表達(dá)量明顯降低，而mRNA水平無明顯變化，提示在腎癌細(xì)胞中miR-34a是在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)YY1進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而起到抑癌的作用。

綜上所述，本試驗(yàn)初步觀察到miR-34a的低表達(dá)可能是腎癌發(fā)生中的重要事件，在腎癌發(fā)生和發(fā)展過程中可能具有重要作用，并初步顯示了miR-34a的抑癌作用有可能部分地通過調(diào)控YY1來實(shí)現(xiàn)。miR-34a有望成為腎癌的診斷和進(jìn)展的分子標(biāo)志物，也可能是腎癌基因治療的一個(gè)有效靶點(diǎn)。然而，包括YY1在內(nèi)的這些靶基因及具體、精確的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

［1］郭應(yīng)祿，周利群．坎貝爾-沃爾什泌尿外科學(xué)［M］．第9版．北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2009:1668-1725．

［2］Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al．Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(24):15524-15529．

［3］Chang TC，Wentzel EA，Kent OA，et al．Transactivation of miR-34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis［J］．Mol Cell，2007，26(5):745-752．

［4］Tazawa H，Tsuchiya N，Izum iya M，et al．Tumorsuppressive miR-34a induces senescence-like growth arrest through modulation of the E2F pathway in human colon cancer cells［J］．Proc Natl Acad SciUSA，2007，104(39):15472-15477．

［5］Welch C，Chen Y，Stallings RL．MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells［J］．Oncogene，2007，26(34):5017-5022．

［6］Lodygin D，Tarasov V，Epanchintsev A，etal．Inactivation of miR-34a by aberrant CpG methylation in multiple types of cancer［J］．Cell Cycle，2008，7(16):2591-2600．

［7］Luan S，Sun L，Huang F．MicroRNA-34a:a novel tumor suppressor in p53-mutantglioma cell line U251［J］．Arch Med Res，2010，41(2):67-74．

［8］Chen QR，Yu LR，Tsang P，etal．Systematic proteome analysis identifies transcription factor YY1 as a direct target of miR-34a［J］．J Proteome Res，2011，10(2):479-487．

［9］Castellano G，Torrisi E，Ligresti G，et al．The involvement of the transcription factor Yin Yang 1 in cancer development and progression［J］．Cell Cycle，2009，8(9):1367-1372．

［10］Rizkallah R，Alexander KE，Kassardjian A，et al．The transcription factor YY1 is a substrate for Pololike kinase 1 at the G2/M transition of the cell cycle［J］．PLoSONE，2011，6(1):e15928．

The inhibition of cell proliferation and invasion through m iR-34a regulating YY1 in human renal carcinoma cell

WANGMingli，LIZhi，XU Jinyu，WENGWenhao，XU Shanshan． (Department of Clinical Laboratory，the Tenth

People's Hospital of Tongji University，Shanghai200072，China)

Objective To investigate miR-34a expression in renal carcinoma cell and the inhibitory effect and regulatingmechanism ofmiR-34a on the proliferation and invasion in human renal carcinoma ACHN cells．M ethods The expressions ofmiR-34a in cancer and pericancerous tissues were detected by real-time polymerase chain reaction(PCR)．ACHN cells were transfected with miR-34amimics and there set blank control group，negative control group and miR-34amimics group．The expression ofmiR-34awasmeasured by real-time PCR 24 h after transfection．The cell proliferation and cell cyclewere determined by 5-dimethylthiazol-2-yl-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)and flow cytometry．The invasive ability was examined by Transwell and Matrigel invasive assays．ThemRNA and protein levels of YY1 were detected by real-time PCR and Western blot．Results The relative expression ofmiR-34a in cancer tissues(1．06 ±0．67)was significantly lower than that in pericancerous tissues(1．62 ±0．83，P ＜0．01)．After transfection 24 h，an increase expression of miR-34a was noted in miR-34a mimics group(157．04 ± 13．01)comparing with negative control group(P ＜0．01)．Overexpression ofmiR-34a significantly inhibited the cell proliferation(P ＜0．01)．The cell cycle was arrested at G0/G1phases．Transwell and Matrigel invasive assays showed that the invasive ability of cellswas significantly suppressed after transfection(P ＜0．01)．YY1 gene had nomRNA expressions after transfection(P ＞ 0．05)．Conclusions The expression of miR-34a is low in renal carcinoma，and it may be correlated with tumorigenesis，partially through regulating YY1．

miR-34a;YY1;Cell proliferation;Invasion;Renal carcinoma

2012-02-09)

(本文編輯:范基農(nóng))

1673-8640(2012)08-0635-06

Q503

A

王明麗，女，1984年生，技師，主要從事分子生物學(xué)檢驗(yàn)工作。通

訊作者:李 智，聯(lián)系電話:021-66306831。