錢(qián) 雷， 汪曉鶯， 呂麗君， 陳德訓(xùn)

(1．濱?？h人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇濱海 224500;2．南通大學(xué)免疫學(xué)教研室，江蘇南通 226001)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者早期外周血
單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體2、4表達(dá)及意義

錢(qián) 雷1， 汪曉鶯2， 呂麗君2， 陳德訓(xùn)1

(1．濱?？h人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇濱海 224500;2．南通大學(xué)免疫學(xué)教研室，江蘇南通 226001)

目的 探討類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)早期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)Toll樣受體(TLR)2、TLR4對(duì)其配體雙糖鏈蛋白多糖(BGN)、脂多糖(LPS)的刺激反應(yīng)性，闡明PBMC TLR2、TLR4在RA疾病早期中的作用。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別檢測(cè)BGN和LPS刺激前后，RA組和健康對(duì)照組外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4+細(xì)胞頻率、PBMC TLR2mRNA和TLR4 mRNA及上清液白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)的含量變化。結(jié)果 RA早期患者TLR2 mRNA明顯升高、TLR4 mRNA下降(P＜0．01);經(jīng)LPS刺激后，RA患者TLR4 mRNA升高3．50倍，而健康對(duì)照組下降到0．11倍;LPS和BGN促進(jìn)了各組PBMC產(chǎn)生IL-6、TNFα，但RA早期患者組上升的倍數(shù)明顯高于健康對(duì)照組。結(jié)論 PBMC TLR2、TLR4參與早期RA的發(fā)生、發(fā)展。

Toll樣受體2;Toll樣受體4;外周血單個(gè)核細(xì)胞;類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是生物的一種模式識(shí)別受體，其主要通過(guò)識(shí)別并結(jié)合病原體相關(guān)分子模式來(lái)啟動(dòng)免疫反應(yīng)。到目前為止，在人體內(nèi)至少有11種TLR相繼被鑒定。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR2、TLR4與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)有重要的關(guān)系。在RA患者滑膜成纖維細(xì)胞中，可檢測(cè)到TLR2、TLR4、TLR3和TLR7［1］;RA關(guān)節(jié)腔滑液中巨噬細(xì)胞與正常巨噬細(xì)胞相比，高表達(dá)TLR2和TLR4［2］。但外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)TLR2、TLR4對(duì)早期RA的影響少見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)檢測(cè) RA早期患者 PBMC TLR2、TLR4，并觀(guān)察對(duì)其各自特異性配體雙糖鏈蛋白多糖(BGN)、脂多糖(LPS)的刺激反應(yīng)性，闡明PBMC TLR2、TLR4在早期RA疾病中的作用。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選取2010年9月至2011年3月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院門(mén)診部就診的RA早期診斷患者20例，符合2009年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟聯(lián)合推出的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，均處于亞急性活動(dòng)期，RA活動(dòng)度評(píng)分(DAS-28)均在2．6～5．1之間。用藥前采集標(biāo)本。健康對(duì)照者20名，無(wú)相關(guān)自身免疫性疾病、腫瘤或近期感染史。各組間性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見(jiàn)表1。

表1 RA早期患者和健康對(duì)照者臨床資料

二、主要試劑和儀器

抗人 TLR4抗體、抗 TLR2抗體、藻紅蛋白(PE)-鼠抗人TLR4抗體購(gòu)自eBioscience公司，異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人CD14、逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品，RPMI 1640培養(yǎng)基溶液購(gòu)自Gibco公司，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物由上海生物工程公司合成，SYBR GreenⅠ購(gòu)自上海閃晶分子生物科技公司，LPS、BGN購(gòu)自 Sigma公司，白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自Bender MedSystems公司，熒光定量PCR儀為Corbett RG-3000。

三、方法

1．LPS、BGN刺激單個(gè)核細(xì)胞 Ficoll-Histopaque液分離10 mL肝素抗凝靜脈血PBMC，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，860×g離心7 min，去上清，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)重懸，分組種于24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，加入不同濃度LPS、BGN(抗人TLR抗體孔在加入刺激劑前將體積為100μL細(xì)胞與5μL抗體先共育30 min)，置于 37℃ 5%CO2溫箱培養(yǎng) 48 h，ELISA檢測(cè)上清液細(xì)胞因子IL-6、TNFα濃度;收集細(xì)胞，PBS洗滌后，檢測(cè) TLR2 mRNA、TLR4 mRNA，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞TLR4+細(xì)胞頻率。

2．實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞TLRmRNA Trizol提取細(xì)胞總RNA，按RT試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。TLR2引物序列，上游:5'-GGAAGAATCCTCCAATCAGGC-3'，下游 5'-CTTCTGTGAGCCCTGAGGGA-3';TLR4引物序列，上游:5'-GAACCTGGACCTGAGCTTTAATC-3'、下 游 5'-AGATTGGATAAGATTGTGAGCCAC-3'，內(nèi)對(duì)照 GAPDH引物序列:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'、下 游 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR采用25μL反應(yīng)體系:2μL cDNA、12．5 μL 2 × SYBR Green Supermix、200 nmol/L上下游引物各1 μL、ddH2O 8．5 μL，按95 ℃ 7 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后做熔解度分析。

3．流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14+單核細(xì)胞TLR4+細(xì)胞頻率 取2×105PBMC，加入100μL PBS，與5 μL PE-鼠抗人 TLR4、5 μL FITC-鼠抗人 CD14室溫避光溫育30 min，PBS洗滌后，用200μL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR4+CD14+細(xì)胞占CD14+細(xì)胞百分比。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Stata統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差齊性、正態(tài)性檢驗(yàn)、兩組比較t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)為0．05。

結(jié) 果

一、RA早期患者未經(jīng)刺激PBMC TLR mRNA表達(dá)

用相對(duì)定量2－ΔΔCt法計(jì)算 TLR mRNA 含量，將一例正常對(duì)照設(shè)定為1，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 RA早期患者PBMC TLRmRNA

二、經(jīng) 50 ng/mL LPS刺激的 PBMC TLR4 mRNA變化

用相對(duì)定量2－ΔΔCt法計(jì)算TLR4 mRNA變化，將其未刺激對(duì)照設(shè)定為1。RA組經(jīng)50 ng/mL LPS刺激后，TLR4 mRNA升高3．50倍(中位數(shù))，而健康對(duì)照組下降到0．11倍(中位數(shù))。

三、經(jīng)50 ng/mL LPS刺激的CD14+單核細(xì)胞TLR4+細(xì)胞頻率的變化

RA早期患者CD14+單核細(xì)胞TLR4+細(xì)胞頻率與健康對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，數(shù)據(jù)未顯示)。用LPS刺激單個(gè)核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)24 h后，RA患者和健康對(duì)照者CD14+單核細(xì)胞表面TLR4表達(dá)均下降，但RA患者下降更加顯著，48 h RA患者TLR4表達(dá)上升，而健康對(duì)照組TLR4表達(dá)持續(xù)下降，見(jiàn)圖1。

四、ELISA檢測(cè)PBMC經(jīng)LPS刺激48 h的上清液 IL-6、TNFα 濃度

經(jīng)50 ng/mL LPS刺激后，上清液IL-6濃度RA組上升了38．90倍，健康對(duì)照組上升了10．20倍;TNFα濃度RA組上升了54．80倍，健康對(duì)照組上升了26．80倍。PBMC與抗TLR4預(yù)先共育后，IL-6、TNFα濃度變化不顯著。見(jiàn)表3。

圖1 經(jīng)LPS刺激的CD14+單核細(xì)胞TLR4+細(xì)胞頻率變化百分率

五、ELISA檢測(cè)PBMC經(jīng)1 ng/mL BGN刺激48 h的上清液IL-6、TNFα濃度。

經(jīng)1 ng/mL BGN刺激后，上清液IL-6濃度RA組上升了2．65倍，健康對(duì)照組上升了1．39倍;TNFα濃度RA組上升了5．76倍，健康對(duì)照組上升了1．39倍。PBMC與抗TLR2預(yù)先共育后，IL-6、TNFα濃度均下降。見(jiàn)表4。

表3 LPS刺激PBMC前后上清液IL-6、TNFα濃度

表4 BGN刺激PBMC前后上清液IL-6、TNFα濃度

討 論

RA是一種以慢性、對(duì)稱(chēng)性多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的自身免疫炎性疾病。目前其病因及發(fā)病機(jī)制不明，但一般認(rèn)為是溶血性鏈球菌或其他細(xì)菌代謝產(chǎn)物、慢病毒或支原體的持續(xù)感染引起遺傳易感個(gè)體的自身免疫反應(yīng)。

小鼠關(guān)節(jié)炎模型研究表明，起始階段通過(guò)TLR2活化促進(jìn)血管的發(fā)生，便于炎癥細(xì)胞黏附與侵襲，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞［3］，在發(fā)病后期，TLR4增加金屬蛋白酶介導(dǎo)的破壞作用和破骨細(xì)胞形成［4］，導(dǎo)致慢性破壞性關(guān)節(jié)炎［5］，并提示內(nèi)源性TLR4配體在關(guān)節(jié)破壞階段發(fā)揮重要作用。Iwahashi等［6］用流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，RA 患者CD16+單核細(xì)胞高表達(dá)TLR2。本研究用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)RA早期患者PBMC TLR2 mRNA表達(dá)，也證實(shí)RA早期患者TLR2顯著增加，提示在人的RA早期，可能也是主要通過(guò)TLR2發(fā)揮疾病的始動(dòng)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)RA早期患者TLR4 mRNA降低，并且PBMC在未刺激的情況下產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-6、TNFα 反而比健康對(duì)照組低，而 IL-6、TNFα的濃度與RA病情嚴(yán)重性密切相關(guān)。PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子低的原因可能是RA早期產(chǎn)生炎癥因子功能較強(qiáng)的單核細(xì)胞向關(guān)節(jié)腔聚集引起炎癥反應(yīng)。盡管RA患者早期PBMC TLR4 mRNA表達(dá)下降，但RA患者的PBMC對(duì)LPS的刺激反應(yīng)性與健康對(duì)照組顯著不同，經(jīng)LPS刺激后，RA患者TLR4 mRNA上升，而健康對(duì)照組顯著下降，可能的機(jī)制是RA患者單個(gè)核細(xì)胞對(duì)配體耐受性較強(qiáng)。用流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，CD14+單核細(xì)胞在LPS刺激24 h后，細(xì)胞表面TLR4表達(dá)下降，但RA患者下降更加顯著，在48 h RA組又上升到未刺激時(shí)的狀態(tài)，而健康對(duì)照組則持續(xù)下降，說(shuō)明RA患者隨著TLR4 mRNA上升，細(xì)胞表面TLR4蛋白表達(dá)恢復(fù)。

Huang等［7］從RA患者關(guān)節(jié)滑液中分離的巨噬細(xì)胞與體內(nèi)單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的巨噬細(xì)胞相比，對(duì)肽聚糖和LPS有更高的反應(yīng)性。本研究用LPS、BGN刺激PBMC，都導(dǎo)致了 IL-6、TNFα 等炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，但RA組上升的倍數(shù)明顯高于健康對(duì)照組，說(shuō)明RA患者PBMC處于活化狀態(tài)。用抗體封閉單個(gè)核細(xì)胞相應(yīng)的TLR后，可使細(xì)胞因子的產(chǎn)生大幅度下降。

業(yè)已證實(shí)，RA患者的關(guān)節(jié)中不僅存在著TLR2和TLR4識(shí)別的微生物來(lái)源的肽聚糖、雙鏈RNA等外源性TLR配體，還存在內(nèi)源性TLR配體，如熱休克蛋白 96［8］、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸等［9］。這些證據(jù)表明RA早期階段，TLR可能通過(guò)識(shí)別外源性、內(nèi)源性配體激活PBMC、滑膜成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，上調(diào)前炎性細(xì)胞因子、趨化因子、組織破壞酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。Sacre等［10］應(yīng)用藥物選擇性抑制TLR信號(hào)途徑，能改善膠原誘導(dǎo)的鼠關(guān)節(jié)炎癥狀，也可以抑制炎性細(xì)胞因子在人RA組織中的產(chǎn)生。

本研究結(jié)果顯示，RA早期患者PBMC TLR2表達(dá)增加、TLR4下降，TLR4對(duì)其配體刺激有較高的反應(yīng)性，產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，說(shuō)明RA患者PBMC處于活化狀態(tài)，通過(guò)TLR受體啟動(dòng)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，合成和釋放炎癥因子，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織和骨組織的破壞。細(xì)菌、病毒的感染通過(guò)單個(gè)核細(xì)胞TLR引起一系列炎癥反應(yīng)可能是RA誘發(fā)因素。因此探討TLR對(duì)RA免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制以及在此環(huán)節(jié)上尋求更有效的疾病干預(yù)靶點(diǎn)具有重要意義。

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Study on the expression and significance of Toll-like receptor 2 and 4 of peripheralblood mononuclear cells in patients w ith early-stage rheumatoid arthritis

QIAN Lei1，WANG Xiaoying2，Lü Lijun2，CHEN Dexun1．(1．

Departmert of Clinical Laboratory，Binhai County People's Hospital，Jiangsu Binhai 224500，China;2．Department of Immunology，Nantong University，Jiangsu Nantong 226001，China)

Objective To investigate the effects of Toll-like receptor(TLR)2 and TLR4 of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in patients with early-stage rheumatoid arthritis(RA)and the responsiveness of TLR4 to lipopolysaccharide(LPS)and TLR2 to biglycan(BGN)．M ethods The expressions of TLR4+/CD14+monocytes，TLR2 mRNA，TLR4 mRNA and cytokines of interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor alpha(TNFα)in supernatantswere analyzed by flow cytometry，real-time fluorescence quantitation reverse transcription(RT)-polymerase chain reaction(PCR)and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)respectively in PBMC before and after stimulation．Results The TLR2 mRNA in PBMC of RA patientswere significantly higher than those of healthy controls(P ＜0．01)．The TLR4 mRNA of RA patients were significantly lower than those of healthy control．LPS increased TLR4 mRNA of RA patients(3．50-fold)and decreased TLR4 mRNA of healthy controls(0．11-fold)．LPS and BGN increased cytokines'production in all groups，while the increased folds of IL-6 and TNFα in PBMC from RA patients were significantly higher than the cells from healthy controls．Conclusions TLR2 and TLR4 of PBMC display important roles in the development of early-stage RA．

Toll-like receptor 2;Toll-like receptor 4;Peripheral blood mononuclear cell;Rheumatoid arthritis

2011-06-05)

(本文編輯:姜 敏)

1673-8640(2012)08-0659-04

R446．62

A

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

錢(qián) 雷，男，1970年生，碩士，副主任技師，主要從事自身免疫性疾病研究。通訊作者:汪曉鶯，聯(lián)系電話(huà):0515-84234889。