李 玲，呂 磊，董 昕，呂狄亞，婁子洋

(第二軍醫(yī)大學(xué),a.藥學(xué)院分析測試中心，上海 200433；b.東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438)

運(yùn)用GC-MS對三種不同方法提取的艾葉揮發(fā)油成分的比較分析

李 玲a，呂 磊b，董 昕a，呂狄亞a，婁子洋a

(第二軍醫(yī)大學(xué),a.藥學(xué)院分析測試中心，上海 200433；b.東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438)

目的運(yùn)用GC-MS對不同提取方法所得的艾葉揮發(fā)油成分進(jìn)行比較分析。方法分別采用水蒸氣蒸餾，正己烷回流，靜態(tài)頂空提取艾葉揮發(fā)油，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合NIST05數(shù)據(jù)庫對分離的化合物進(jìn)行鑒定，并應(yīng)用峰面積歸一化法計算各成分的相對含量。結(jié)果3種方法共鑒別出艾葉中80個揮發(fā)油成分，其中靜態(tài)頂空進(jìn)樣59個，水蒸氣蒸餾37個，正己烷回流31個。結(jié)論結(jié)合水蒸氣蒸餾和靜態(tài)頂空進(jìn)樣兩種方法可以建立更全面的艾葉揮發(fā)性成分GC-MS表征體系；靜態(tài)頂空進(jìn)樣在揮發(fā)油成分鑒別上存在一定優(yōu)勢。

艾葉；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用；靜態(tài)頂空進(jìn)樣；桉油精

艾葉為菊科植物艾ArtemisiaargyiLevi.et Vant的干燥葉，為歷版《中國藥典》(一部)收載的品種，具有散寒止痛、溫經(jīng)止血的功效[1]。大量的藥理研究證明艾葉具有抗菌抗病毒，鎮(zhèn)咳平喘，護(hù)肝利膽及抗過敏等作用[2,3]。艾葉的揮發(fā)油為其重要的有效成分，如桉油精具有平喘和抑制炎癥等作用，可用于哮喘，神經(jīng)痛及皮膚病的治療[4]。另外艾葉揮發(fā)油對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、真菌均具有強(qiáng)抑菌作用，還對呼吸道合胞病毒有抑制作用[5]，具有廣闊的應(yīng)用前景。

艾葉揮發(fā)油傳統(tǒng)的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、溶劑提取法、超臨界流體萃取法等[6]，其中以水蒸氣蒸餾法最為常用，其提取工藝要求高溫且提取時間較長，故一些低沸點的揮發(fā)性成分或熱敏性成分容易被破壞；溶劑提取法可根據(jù)化合物性質(zhì)的差異，采用不同的溶劑提取不同種類的化合物；頂空進(jìn)樣是通過樣品基質(zhì)上方的氣體來測定該樣品中的組分和含量一種間接分析方法, 該方法操作簡便，樣品用量少，既免除了冗長煩瑣的樣品前處理過程，又可避免有機(jī)溶劑帶入的雜質(zhì)對分析造成干擾，減少了對色譜柱污染及對分析人員和環(huán)境的危害，另外，與其它提取方法相比既可避免在除去溶劑或高溫提取過程中引起揮發(fā)性成分的損失，又可降低共提物引起的噪音，具更高靈敏度和分析速度。艾葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析已有報道[7～9]，但未有將這三種方法進(jìn)行比較分析的研究。本實驗首次將水蒸氣蒸餾，正己烷回流以及靜態(tài)頂空進(jìn)樣得到艾葉揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS比較分析[10]，為艾葉揮發(fā)油成分的鑒別及資源的合理利用提供了參考依據(jù)。

1 儀器和試劑

氣相色譜Thermo Trace GC Ultra，質(zhì)譜Thermo DSQII，頂空自動進(jìn)樣器Thermo Triplus HS(美國賽默飛世爾公司), Xcalibur工作站。揮發(fā)油測定器(上海華連醫(yī)療器械有限公司)，METTLER AE240型電子天平(瑞士梅特勒公司)；LX-02藥材粉碎機(jī)(上海利祥公司)。

藥材艾葉(產(chǎn)地安徽，批號20110803)購自上海雷允上大藥房，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室黃寶康副教授鑒定確為菊科植物艾ArtemisiaargyiLevi.et Vant的干燥葉。所用試劑正己烷為分析純，水為重蒸水，載氣為高純氦氣。

2 試驗方法

2.1提取方法

2.1.1水蒸氣蒸餾 取粉碎后的艾葉藥材50 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加蒸餾水，按照2010年版《中國藥典》(一部)附錄“揮發(fā)油測定法”中甲法提取揮發(fā)油，得到淡綠色、味濃香的油狀液體，樣品以5ml正己烷溶解，稀釋100倍后取1μl注入氣相色譜儀。

2.1.2正己烷回流 取粉碎后的艾葉藥材5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入正己烷50 ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用正己烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液1 μl注入氣相色譜儀。

2.1.3靜態(tài)頂空 取粉碎后的艾葉藥材0.1 g，精密稱定，置10 ml頂空進(jìn)樣瓶中，用密封瓶蓋密封；孵化箱溫度110 ℃，孵化時間40 min，進(jìn)樣針溫度115 ℃，進(jìn)樣體積1 ml。

2.2色譜及質(zhì)譜條件

2.2.1色譜條件 色譜柱HP-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，分流比10:1，進(jìn)樣口溫度200 ℃，程序升溫：起始溫度40 ℃，以3 ℃/min 的速率升至100 ℃，然后以10 ℃/min升至200 ℃并保持7 min，傳輸線溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，流速1 ml/min。

2.2.2質(zhì)譜條件 離子源：EI源；離子源溫度：250 ℃；電子能量：70 ev；掃描范圍(m/z)：50～350。

3 結(jié)果

按2.1和2.2項下實驗條件分別對艾葉進(jìn)行提取分析，37 min得到艾葉揮發(fā)油成分的總離子流圖，如圖1所示。通過檢索NIST05數(shù)據(jù)庫，結(jié)合參考文獻(xiàn)[11～14]，以相似度SI>800為依據(jù)，初步鑒定出3種提取方法下得到的艾葉揮發(fā)油成分80個，以除溶劑以外的全部色譜峰面積作為100%，通過面積歸一化法計算得出各成分的相對百分含量，結(jié)果如表1所示。

圖1 艾葉揮發(fā)性成分總離子流圖

表1 艾葉揮發(fā)性成分分析結(jié)果

編號保留時間(t/min)化合物名稱分子式分子量相似度相對含量(%)SDHRESH4922．693-甲基?6?(1?甲基乙基)?2?環(huán)己烯?1?酮(3?methyl?6?(1?methylethyl)?2?Cyclohexen?1?one)C12H20O3212864——0．095022．92，6，6?三甲基，醋酸雙環(huán)[3．1．1]庚-2?烯?4?醇(2，6，6?Trimethyl?，acetatebicyclo[3．1．1]hept?2?en?4?ol)C12H18O2194834——0．085123．114，6?二甲基十二烷(4，6?Dimethyl?Dodecane)C14H30198847—1．15—5223．49乙酸龍腦酯(Bornylacetate)C12H20O21969050．14—0．195323．892?甲基?5?(1?甲基乙基)苯酚(2?Methyl?5?(1?methylethyl)?pheno)C10H14O1508590．16——5424．63反?3?甲基?6?(1?甲基乙基)?2?環(huán)己烯?1?醇(Trans?3?methyl?6?(1?methylethyl)?2?Cyclohexen?1?ol)C10H18O154850——0．105524．71古巴烯(Copaene)C15H24204821——0．105624．83蓽澄茄油烯醇(Cubenol)C15H26O222802——0．115724．97丁香酚(Eugenol)C10H12O21648240．22—0．195825．32胡椒烯(Copaene)C15H24204875——0．085926．09石竹烯(Caryophyllene)C15H242049251．20—0．516026．452，6，10?三甲基?十二烷(2，6，10?Trimethyl?Dodecane)C15H32212848—1．49—6126．862，6，10?三甲基?十四烷(2，6，10?Trimethyl?Tetradecane)C17H36240839—1．09—6226．962?甲基?十三(2?methyl?Tridecane)C14H30198841—2．26—6327．144(14)，11?桉葉二烯(Eudesma?4(14)11?diene)C15H242049151．11—0．306427．21喇叭烯(Ledene)C15H242048070．58——6527．422，4?雙(1，1?二甲基)苯酚(2，4?bis(1，1?dimethylethyl)?Phenol)C14H22O206832—1．55—6627．53檸檬烯?6?醇新戊酸鹽(Limonen-6?olpivalate)C15H24O22368410．25——6727．75(E)3，6?二甲基?3?(1?甲基乙基)?4，6?庚二烯?2?酮(E)3，6?Dimethyl?3?(1?methylethyl)?4，6?heptadien?2?one)C12H20O204832——0．296828．41匙葉桉油烯醇(Spathulenol)C15H24O2208922．021．490．216928．5石竹烯氧化物(Caryophylleneoxide)C15H24O2209209．114．450．867028．83環(huán)氧白菖烯(Calareneepoxide)C15H24O2208901．94——7129．18異長葉醇(Isolongifolol)C15H26O222822—4．580．457229．4桉葉烷?7(11)?烯?4?醇(Eudesm?7(11)?en?4?ol)C15H26O22286722．8611．872．427329．573，7，11?三甲基?(E)?1，6，10?十二烷三烯?3?醇(3，7，11?Trimethyl?(E)?1，6，10?dodecatrien?3?ol)C15H24O2208223．961．79—7429．74順式?Z?沒藥烯環(huán)氧物(Cis?Z?bisaboleneepoxide)C15H24O2208470．16——7530．77c?環(huán)氧化古蕓烯(c?Gurjunenepoxide)C15H24O2208101．76——7631．35異香橙烯環(huán)氧物(Isoaromadendreneepoxide)C15H24O2208205．371．160．567731．646，10，14?三甲基?2?十五烷酮(6，10，14?Trimethyl?2?pentadecanone)C18H36O2688281．531．86—7832．98α?廣木香醇(α?Costol)C17H24O3276814—1．79—7933．32異植醇(Isophytol)C20H40O2968165．670．23—8033．44十六烷酸(Hexadecanoicacid)C16H32O22568741．08——

4 討論

本實驗采用了傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾，正己烷回流和靜態(tài)頂空進(jìn)樣3種方法提取艾葉的揮發(fā)油，初步鑒別出80個成分，其中靜態(tài)頂空進(jìn)樣59個，水蒸氣蒸餾37個，正己烷回流31個。通過NIST05譜庫檢索，并采用峰面積歸一化法計算，其主要成分及相對含量存在一定差異。用水蒸氣蒸餾法得到的揮發(fā)油中桉葉烷-7(11)-烯-4-醇和氧化石竹烯的相對含量較高，分別為22.86%和9.11%；在正己烷回流中相對含量較高的成分為桉油精和桉葉烷-7(11)-烯-4-醇，分別為13.21%和11.87%；在靜態(tài)頂空進(jìn)樣中相對含量較高的成分為桉油精和蒿醇，分別為38.56%和8.99%。

水蒸氣蒸餾法是中藥揮發(fā)油提取中最經(jīng)典的方法，操作相對容易，成本較低，適用于絕大多數(shù)的中藥揮發(fā)油的提取。由圖1可以看出，水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油成分相對含量較高的組分主要集中在25～35 min時間段，為沸點相對較高的一些成分，而在靜態(tài)頂空進(jìn)樣中相對含量較高的組分主要集中在10～20 min時間段，為沸點相對較低的一些成分。由于水蒸氣蒸餾法提取時間較長，溫度較高，提取過程中一些沸點較低及易氧化的成分容易丟失。靜態(tài)頂空進(jìn)樣對于這些低沸點的成分保留良好，但由于頂空進(jìn)樣的孵化箱加熱溫度的高溫限制，一些高沸點的成分難以完全被提取檢測到。因此，將水蒸氣蒸餾法和靜態(tài)頂空進(jìn)樣結(jié)合起來分析，有利于建立更全面的艾葉揮發(fā)油成分的化學(xué)信息。

正己烷回流得到的艾葉揮發(fā)油的主要成分為桉油精，桉葉烷-7(11)-烯-4-醇，長鏈脂肪酸及長鏈烷烴等，從成分上看，該方法與水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油的在數(shù)量上沒有明顯的差異。從峰相對含量上看，正己烷回流提取所得艾葉的主要有效成分桉油精相對含量最高，進(jìn)一步佐證了2010年版《中國藥典》用正己烷回提取艾葉中的桉油精并測定其含量作為艾葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的意義。

靜態(tài)頂空進(jìn)樣操作簡單，樣品用量少，不需要任何溶劑，不需要高溫提取，既減少了污染又避免了一些熱敏性成分的破壞，在中藥揮發(fā)油的定性分析中已有較多的應(yīng)用。在定量方面，含量測定的方法還未得到完全認(rèn)可，但已有報道用頂空進(jìn)樣結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)加入法測定中藥材中揮發(fā)性成分的含量[15]。隨著頂空進(jìn)樣在中藥揮發(fā)性成分分析中越來越多的應(yīng)用，相信在含量測定方面也會得到更多的肯定。

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AnalysisofvolatileoilfromArtemisiaargyiLevi.etVantextractedbythreedifferentmethodsbyGC-MS

LI Linga, LV Leib, DONG Xina, LV Di-yaa,LOU Zi-yanga

(Second Military Medical University,a.Pharmaceutical Analysis Center, School of Pharmacy,Shanghai 200433,China; b.Department of Pharmacy, Shanghai Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai 200438,China)

ObjectiveTo analyze the the compositions of volatile oil fromArtemisiaargyiLevi.et Vant extracted by three different methods by GC-MS.MethodsThe volatile oil fromArtemisiaargyiLevi.et Vant were extracted by Steam distillation, Hexane reflux extraction and Static headspace. GC-MS was used for the separation and identification.ResultsBy the three methods, 80 compounds were identified. 59 components were extracted by static headspace, 37 by steam distillation and 31 by hexane reflux extraction.ConclusionCombination of steam distillation and static headspace, sampling was feasible to establish GC-MS representation system forArtemisiaargyiLevi.et Vant; there were certain advantages of static headspace in determination of volatile oil contant.

ArtemisiaargyiLevi.et Vant；GC-MS；static headspace；eucalyptol

李 玲，女，碩士研究生，實驗師.E-mail:316262150@163.com.

[作者簡介] 婁子洋.Tel：(021)81871335，E-mail:louziyang@126.com.

R917

A

1006-0111(2012)04-0279-05

10.3969/j.issn.1006-0111.2012.04.09

2012-05-08

2012-05-29