劉莉萍,歐陽(yáng)取長(zhǎng),曹建國(guó),向紅琳,全梅芳

(1.湖南省腫瘤醫(yī)院乳腺內(nèi)科,湖南長(zhǎng)沙,410013;2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物工程實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙,410013)

乳腺癌成為婦女發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]。目前,化學(xué)藥物治療雖在化學(xué)綜合治療中占據(jù)重要地位,但因其嚴(yán)重的毒副作用及容易產(chǎn)生耐藥性,其臨床應(yīng)用價(jià)值極大地減少。因此,研制高效低毒的乳腺癌靶向藥物具有重大現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的臨床應(yīng)用前景。叉頭盒轉(zhuǎn)錄基因M1(FoxM1)是叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一[2],已被證明能調(diào)控細(xì)胞周期G1/S期和G2/M期運(yùn)轉(zhuǎn)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄,包括細(xì)胞分裂周期蛋白基因(cdc25A,cdc25B),細(xì)胞周期蛋白(cyclin B,cyclin D1,p21蛋白和p27蛋白)[3-5]。研究[6]表明,FoxM1信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在人類乳腺癌中存在FoxM1高表達(dá)。因此FoxM1可能成為抗乳腺癌藥物作用新標(biāo)靶。7-二氟甲氧基-5,4′-二-正辛烷氧基金雀異黃素(DFOG)是本研究對(duì)金雀異黃素(GEN)進(jìn)行化學(xué)改造獲得的新化學(xué)實(shí)體。Wang等[7]研究提示FoxM1可能是GEN抗胰腺癌的新靶標(biāo)。此外,本組最近研究表明[8]DFOG通過(guò)調(diào)控FoxM1信號(hào)途徑發(fā)揮抗卵巢癌作用,較先導(dǎo)化合物GEN抗腫瘤活性更強(qiáng)。本研究旨在探討DFOG抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡作用及其抗乳腺癌作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

DFOG(分子量:544,性狀:黃色粉末,純度:98%)參照文獻(xiàn)[9]方法制備;碘化丙啶(PI,Sigma公司);GEN(美國(guó) Sigma公司);小鼠抗人FoxM1、CDK1、cyclin B、p27kip1和 β-actin 一抗以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體;ECL Western blot檢測(cè)試劑盒;脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,將其放入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,加入青霉素100 U/mL+鏈霉素100 U/mL,于37℃及5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。

1.3 平皿集落形成法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×103/mL。以每孔 900 μL接種于 24孔板。待細(xì)胞貼壁后,分別加入 100 μL配制好的各濃度DFOG(終濃度分別為 10.0 、20.0、40.0 μ mol/L)和GEN(終濃度為 80 μ mol/L)培養(yǎng)基 ,并且設(shè)立空白對(duì)照組和溶媒對(duì)照組[加入含0.1%二甲基亞砜(DMSO)],每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔,加藥的培養(yǎng)基每隔2 d換1次,置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d,經(jīng)固定、染色后倒置顯微鏡下記錄細(xì)胞形成的克隆集落數(shù),集落抑制率IR%=(1-處理組集落均數(shù)/對(duì)照組集落均數(shù))×100%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 PI染色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析

按照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行,用EPICS XL型流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的DNA含量,并用SYSTEM II軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western Blot分析

按照先前文獻(xiàn)[10]描述的方法完成。小鼠抗人FoxM1 、CDK1、cyclin B 、p27kip1和 β-actin 用于一抗,山羊抗小鼠IgG抗體作為二抗反應(yīng)。用增強(qiáng)型ECL蛋白質(zhì)印跡分析系統(tǒng)檢測(cè)目的條帶信號(hào)。

1.6 FoxM1 siRNA轉(zhuǎn)染

FoxM1 siRNA購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,人乳腺癌MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒,按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)FoxM1基因表達(dá)

收集各組細(xì)胞,TRlzol提取總RNA和逆轉(zhuǎn)錄cDNA的合成按試劑盒說(shuō)明書操作。引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及條件按文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行,所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 DFOG對(duì)乳腺癌細(xì)胞集落形成的影響

經(jīng)不同濃度DFOG(10.0、20.0、40.0μ mol/L)作用6 d后,乳腺癌細(xì)胞克隆形成數(shù)逐漸減少,克隆形成率逐漸下降,MCF-7細(xì)胞的集落抑制率分別26.7%、61.6%和84.9%,MDA-MB-453細(xì)胞為22.4%、51.3%、72.4%,均明顯低于溶媒對(duì)照組(P<0.05),GEN對(duì)照組對(duì)乳腺癌MCF-7與MDA-MB-453細(xì)胞的克隆形成抑制率分別為55.8%、44.7%。表明DFOG以濃度依賴的方式顯著抑制MCF-7與MDA-MB-453細(xì)胞生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

圖1 DFOG對(duì)MCF-7與MDA-MB-453細(xì)胞集落形成的影響(,n=3)

2.2 DFOG對(duì)乳腺癌MCF-7與MDA-MB-453細(xì)胞周期分布的影響

FCM分析發(fā)現(xiàn),與溶媒對(duì)照組比較,DFOG(10.0、20.0 、40.0 μ mol/L)處理 24 h,隨藥物濃度增大MCF-7與MDA-MB-453細(xì)胞系G2期細(xì)胞百分率逐次增加;同時(shí),G1和S期細(xì)胞百分率逐漸減少,見(jiàn)圖 2。DFOG將 MCF-7與MDAMB-453細(xì)胞阻滯于G2/M期。

圖2 DFOG對(duì)MCF-7與MDA-MB-453細(xì)胞周期的影響(,n=3)

2.3 DFOG對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡率的影響

PI染色FCM 分析結(jié)果表明,DFOG(10.0、20.0 和 40.0 μ mol/L)處理 48 h,DFOG 按照濃度依賴的方式顯著誘導(dǎo)MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞凋亡率增加,見(jiàn)圖3。

圖3 DFOG對(duì)MCF-7與MDA-MB-453細(xì)胞凋亡率的影響(,n=3)

2.4 DFOG對(duì)乳腺癌細(xì)胞FoxM1及其下游基因產(chǎn)物表達(dá)的影響

Western blotting分析結(jié)果顯示,DFOG以濃度依賴的方式下調(diào)MCF-7與MDA-MB-453細(xì)胞FoxM1及其下游蛋白 CDK1、cyclin B、survivin 表達(dá),上調(diào)p27kip1蛋白表達(dá),見(jiàn)圖4。

圖4 DFOG對(duì)MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞FoxM1及其下游基因產(chǎn)物表達(dá)的影響

2.5 抑制FoxM1基因表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響

Western blotting結(jié)果表明,與溶媒對(duì)照組相比,FoxM1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞FoxM1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。同時(shí),FCM分析結(jié)果顯示:FoxM1 siRNA轉(zhuǎn)染能可使DFOG誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡率的增加(P<0.05),見(jiàn)圖5。這些結(jié)果充分說(shuō)明下調(diào)FoxM1蛋白表達(dá)是DFOG誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

圖5 抑制FoxM1基因表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子FoxM1是Forkhead Box轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,與細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育、衰老、再生和腫瘤等許多病理生理過(guò)程密切相關(guān)。研究[11]表明,FoxM1信號(hào)在細(xì)胞發(fā)育途徑中起著重要的作用,包括維持細(xì)胞增殖和凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡,所以FoxM1基因的非正常激活已成為癌變組織的重要特征之一。目前發(fā)現(xiàn),在人類大多數(shù)腫瘤中FoxM1都具有較高的表達(dá)水平[12-13]。FoxM1在細(xì)胞中的特殊功能以及與腫瘤的密切關(guān)系,使之成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。研究[6-7,14]表明,thiostrepton、Gen和gefitinib等多種藥物對(duì)FoxM1的表達(dá)具有抑制作用。

本文的研究結(jié)果表明,DFOG及其先導(dǎo)化合物GEN以濃度依賴的方式抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡,并且伴隨G2/M期細(xì)胞周期阻滯。DFOG能下調(diào)FoxM1及其下游靶標(biāo)分子CDK1、cyclin B、survivin表達(dá),上調(diào)p27kip1蛋白表達(dá)。眾所周知,CDK1、cyclin B和p27蛋白均為調(diào)控細(xì)胞周期G2向M期運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)鍵因子[15],因此,這些結(jié)果充分說(shuō)明FoxM1通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK1、cyclin B和CDK抑制因子p27的表達(dá)影響人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。另一方面,survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員,表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織中,而在正常組織中未見(jiàn)有表達(dá)。survivin主要表達(dá)于細(xì)胞周期的G2/M期,它可直接抑制細(xì)胞凋亡下游終端效應(yīng)器Caspase-3、Caspase-7的活性,從而阻斷細(xì)胞的凋亡過(guò)程[16]。綜上所述,DFOG和GEN介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)凋亡作用可能與FoxM1信號(hào)途徑的抑制有關(guān)。

本研究將FoxM1 siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,以便進(jìn)一步證明FoxM1是否介導(dǎo)DFOG誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡,Western blotting結(jié)果表明,與溶媒對(duì)照組相比,FoxM1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞FoxM1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。同時(shí),FoxM1 siRNA轉(zhuǎn)染能可使DFOG誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡率的增加。這些結(jié)果充分說(shuō)明下調(diào)FoxM1蛋白表達(dá)是DFOG誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一。

總之,DFOG具有抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的作用,其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制涉及下調(diào)細(xì)胞內(nèi)FoxM1表達(dá)水平。

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