蘇 沐,張全安

(江蘇省南京市第二醫(yī)院腫瘤二科,江蘇南京,210003)

腫瘤細(xì)胞中存在一群生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)特點(diǎn)與干細(xì)胞基本特性十分相似的細(xì)胞,這些細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞或腫瘤起源細(xì)胞,具有自我更新和無限增殖的能力,對腫瘤的存活、增殖、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有著重要作用[1-3]。在研究腦膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞的過程中,有學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn),人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中形成細(xì)胞球,這種細(xì)胞球由于富集腫瘤干細(xì)胞而被稱之為腫瘤干細(xì)胞球,這種富集腫瘤干細(xì)胞的方法之后被廣泛用于其他實(shí)體瘤腫瘤干細(xì)胞的研究中。這一類為數(shù)極少的細(xì)胞群數(shù)量極少,但卻能瘤性克隆生長,被認(rèn)為是治療后復(fù)發(fā)的重要原因之一。因此,研究腫瘤干細(xì)胞有利于進(jìn)一步了解腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥機(jī)制,為更合理的制定治療方案奠定基礎(chǔ)。結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤,約有40%～50%的患者因?yàn)閺?fù)發(fā)需要行放療或/和化療,因此研究結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞可一定程度上為臨床針對性用藥提供依據(jù),具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

無血清培養(yǎng)基(SFM)為不含牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基,并在其中加入重組表皮生長因子(EGF)(20 μg/L,PeproTech)、堿性成纖維生長因子(bFGF)20 μg/L(PeproTech公司)、白血病抑制因子(LIF)20 μg/L(PeproTech 公司)、L-谷氨酰胺 2 mmol/L(Sigma公司)、尼克酰胺10 mmol/L(Sigma公司)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)5 mmol/L、青霉素G 105 U/L和鏈霉素100 mg/L。其他試劑及儀器包括:四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、Hoechst33342(Sigma公司)、Trizol裂解液、Musashi-1及CD133抗體(B&D 公司)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司)、光學(xué)顯微鏡、CO2恒溫箱細(xì)胞培養(yǎng)、生物超凈工作臺(tái)、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞分析(FCM)儀,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀。

1.2 方法

1.2.1 原代結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng):新鮮手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織,在6孔板中用含青霉素及鏈霉素的DMEM/F12(1∶1)后的腫瘤組織置于含有Ⅱ型膠原酶400 U/mL的無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)箱中消化3 h,300×g離心3次,徹底去除膠原酶,用DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基洗滌。SFM 法培養(yǎng)分離獲得的結(jié)腸癌細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞生長到80%融合時(shí),傳代。培養(yǎng)的前4代細(xì)胞在傳代時(shí)每次都保留部分細(xì)胞凍存于液氮中。

1.2.2 SFM條件下原代人結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng):原代培養(yǎng)獲得的人結(jié)腸癌細(xì)胞,經(jīng)5-氟尿嘧啶(5-Fu)25 mg/L、鹽酸伊立替康(CPT-11)50 mg/L、奧沙利鉑(L-OHP)50 mg/L及培美曲塞50 mg/L處理后的原代結(jié)腸癌細(xì)胞分別在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d,觀察腫瘤干細(xì)胞球的形成過程,計(jì)數(shù)腫瘤干細(xì)胞球(>60 μ m)數(shù)目,并計(jì)算細(xì)胞球形成率(細(xì)胞球數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.2.3 FCM檢測側(cè)群(SP)細(xì)胞比例:將每組細(xì)胞均分置于A、B 2管中,以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min;2管中均加入 5 μg/mL Hoechst33342染色液及無血清DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)液;再將50μ mol/L維拉帕米加入B管內(nèi),37℃水浴90min,后置于4℃環(huán)境中,檢測SP細(xì)胞比例。SP細(xì)胞比例=A管中Hoechstlo比例-B管中Hoechstlo比例。1.2.4 FCM檢測細(xì)胞表面分子CD133的表達(dá):將細(xì)胞 800 r/min離心 5 min,分別加入 20 μL CD133單克隆抗體(4℃,30 min),使用冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次,于FCM 上檢測CD133+細(xì)胞比例。

1.2.5 RT-PCR半定量檢測 Musashi-1 mRNA表達(dá):采用Trizol法提取細(xì)胞的RNA,瓊脂糖凝膠電泳初步評價(jià)RNA質(zhì)量,分光光度儀測定總RNA純度。將每組RNA調(diào)至每個(gè)反應(yīng)體系中含1 μg。Musashi-1引物上游序列為5′-GGCT TCGTCACT TACATGGACCAGGCG-3′,下游引物序列為5′-GGAAACTGGTAGGTGTAG-3′;擴(kuò)增產(chǎn)物為542 bp;內(nèi)參為GAPDH,產(chǎn)物為216 bp。瓊脂糖電泳RT-PCR產(chǎn)物,數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.2.6 Western-Blot檢測Musashi-1蛋白的表達(dá):細(xì)胞加入RIPA裂解液,提取總蛋白質(zhì),BCA法測定蛋白濃度,分裝后-80℃保存。配制濃度6%、12%的分離膠和5%的濃縮膠。蛋白上樣,SDSPAGE電泳后,使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜浸置于含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST液)中封閉2 h,封閉后孵育小鼠抗人ABCG2,4℃,過夜,次日用PBST液充分洗滌后,室溫下辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育2 h,PBST洗滌后,使用ECL發(fā)光試劑盒,在Bio-Rad凝膠成像儀下,對PVDF膜進(jìn)行圖像采集分析。取等量的蛋白樣品,通過Western-Blot測量各組細(xì)胞中β-actin的表達(dá)量,以此作為蛋白表達(dá)的內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤干細(xì)胞球的形成及形成率

原代培養(yǎng)獲得的人結(jié)腸癌細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基生長1周,大部分不貼壁,少部分形成大小不等的細(xì)胞球,形狀較規(guī)則,球內(nèi)折光性較好,球內(nèi)細(xì)胞數(shù)增多,細(xì)胞間連接致密,難以區(qū)分細(xì)胞間的分界。經(jīng)5-Fu、CPT-11、L-OHP及培美曲塞處理后的原代人結(jié)腸癌細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中生長1周,亦有少部分形成腫瘤干細(xì)胞球,其細(xì)胞球形成率有差別。與空白對照組比較,經(jīng)5-Fu、CPT-11、L-OHP及培美曲塞處理后的人結(jié)腸癌細(xì)胞在SFM中形成腫瘤干細(xì)胞球的比例增加(P<0.01);每2種藥物之間比較均存在一定差異,但培美曲塞組與其他各組間最為差異明顯(P<0.01)。見表1。

2.2 化療藥物聯(lián)合SFM培養(yǎng)對SP細(xì)胞的影響

與空白對照組比較,經(jīng)5-Fu、CPT-11、L-OHP及培美曲塞處理后的SP細(xì)胞均顯著增加(P<0.01);每2種藥物之間比較均存在一定差異,但培美曲塞組與其他各組間差異最為明顯(P<0.01)。各組SP細(xì)胞比例見圖1、表1。

表1 各組人結(jié)腸癌細(xì)胞在SFM中腫瘤干細(xì)胞球形成率及SP細(xì)胞比例(n=5,,%)

表1 各組人結(jié)腸癌細(xì)胞在SFM中腫瘤干細(xì)胞球形成率及SP細(xì)胞比例(n=5,,%)

與空白對照組比較,＊＊P<0.01;與培美曲塞組比較,##P<0.01。

組別 腫瘤干細(xì)胞球形成率 SP細(xì)胞比例空白對照組 4.27±0.01 5.02±0.115-Fu組 6.15±0.23＊＊## 6.11±0.45＊＊##CPT-11組 7.22±0.43＊＊## 7.87±0.66＊＊##L-OHP組 8.16±0.21＊＊## 8.65±0.56＊＊##培美曲塞組 10.35±0.16＊＊ 9.87±0.32＊＊

圖1 各組SP細(xì)胞比例

2.3 化療藥物聯(lián)合SFM培養(yǎng)對Musashi-1表達(dá)的影響

2.3.1 各組Musashi-1 mRNA的表達(dá):通過圖像處理系統(tǒng)上分析得出Musashi-1和GAPDH的光密度,以GAPDH的光密度為參照物,得到Musashi-1 mRNA表達(dá)的半定量結(jié)果。與空白對照組比較,經(jīng)5-Fu、CPT-11、L-OHP及培美曲塞處理后的 Musashi-1 mRNA表達(dá)均增加(P<0.01);每2種藥物之間比較均存在一定差異,但培美曲塞組與其他各組間差異最為明顯(P<0.01)。見表2。

2.3.2 各組Musashi-1蛋白的表達(dá):與空白對照組比較,經(jīng)5-Fu、CPT-11、L-OHP及培美曲塞處理后Musashi-1蛋白的表達(dá)增加,培美曲塞組最為明顯,見圖 2。

圖2 各組Musashi-1蛋白的表達(dá)

2.4 化療藥物聯(lián)合SFM培養(yǎng)對CD133+表達(dá)的影響

與空白對照組比較,經(jīng) 5-Fu、CPT-11、L-OHP及培美曲塞處理后的人結(jié)腸癌細(xì)胞CD133+細(xì)胞比例增加(P<0.01);每2種藥物之間比較均存在一定差異,但培美曲塞組與其他各組間差異最為明顯(P<0.01)。見表2。

表2 各組人結(jié)腸癌細(xì)胞Musashi-1 mRNA的表達(dá)及CD133+細(xì)胞比例(n=5,)

表2 各組人結(jié)腸癌細(xì)胞Musashi-1 mRNA的表達(dá)及CD133+細(xì)胞比例(n=5,)

與空白對照組比較,＊＊P<0.01;與培美曲塞組比較,##P<0.01。

組別 Musashi-1/GAPDH CD133+細(xì)胞比例(%)空白對照組 0.226±0.023 6.61±0.20365-Fu組 0.301±0.005＊＊## 11.98±0.0198＊＊##CPT-11組 0.425±0.040＊＊## 12.33±0.2014＊＊##L-OHP組 0.478±0.047＊＊## 11.88±0.5891＊＊##培美曲塞組 0.695±0.025＊＊ 14.86±0.1069＊＊

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源,其數(shù)量少,分離困難,成為影響腫瘤干細(xì)胞研究的重要因素之一。最早是在血液腫瘤中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞,近10余年先后在乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、大腸癌、肺癌、腎癌、前列腺癌[4-8]等實(shí)體腫瘤中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀篩選細(xì)胞表面標(biāo)記物[5]及SP細(xì)胞分選法[9]廣泛用于腫瘤干細(xì)胞的分選,但這2種分選法在分選過程均會(huì)對細(xì)胞造成傷害。多種人腫瘤細(xì)胞,如腦腫瘤、乳腺癌、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤等,在無血清培養(yǎng)基中能形成具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞球,其成為富集腫瘤干細(xì)胞的有效方法,給腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)的理論研究和實(shí)踐帶來了新的啟示。

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為[1],腫瘤干細(xì)胞大多數(shù)處于休眠狀態(tài),停滯于細(xì)胞周期中的G0期,其多數(shù)耐藥蛋白高表達(dá),因此對化療不敏感,而成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。無血清培養(yǎng)的懸浮培養(yǎng)可使細(xì)胞維持在未分化的狀態(tài)[10]。在無血清培養(yǎng)條件下,未分化的腫瘤細(xì)胞較已分化的細(xì)胞能耐受無血清條件而免于凋亡,并可以在添加生長因子的的情況下增殖形成細(xì)胞球[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)小組之前的研究發(fā)現(xiàn),5-Fu可富集人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中的腫瘤干細(xì)胞;后在原代培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞的無血清培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)5-Fu有類似地富集腫瘤干細(xì)胞的作用。因此,本研究將臨床上常用于結(jié)腸癌治療的化療藥物與無血清懸浮培養(yǎng)法相結(jié)合,對原代人結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行研究。結(jié)果表明,經(jīng)5-Fu、L-OHP、CPT-11及培美曲塞處理后的人結(jié)腸癌細(xì)胞在SFM中形成干細(xì)胞球的能力增強(qiáng);且與空白對照組相比,SP細(xì)胞比例、Musashi-1及CD133表達(dá)均有增加。有理由認(rèn)為,與單純SFM培養(yǎng)比較,聯(lián)合化療藥物可有效進(jìn)一步富集人結(jié)腸細(xì)胞中的腫瘤干細(xì)胞,但是除培美曲塞組與其他化療藥物的作用差異較為顯著外,其余藥物之間腫瘤干細(xì)胞的富集作用不十分明顯,其原因有待于進(jìn)一步的研究。

本研究再次用SFM培養(yǎng)法富集了原代培養(yǎng)獲得的人結(jié)腸癌細(xì)胞中的腫瘤干細(xì)胞,且發(fā)現(xiàn)與化療聯(lián)合可強(qiáng)化富集作用,不同藥物存在一定的差別,為進(jìn)一步研究腫瘤干細(xì)胞在腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

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