賈艷花 劉海燕 楊 寧 楊更亮

（河北大學(xué)藥學(xué)院，河北省藥物質(zhì)量重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002）

整體柱材料研究在過去的二十幾年中取得了很大的進(jìn)展，它主要分為有機(jī)聚合物整體柱[1-4]和硅膠整體柱[5-7]兩大類，有機(jī)聚合物整體柱在一定的pH范圍內(nèi)具有良好的生物相容性，但在有機(jī)溶劑中具有溶脹作用易導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的變化；硅膠整體柱雖然具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，但是在一定的酸性條件和輕微的堿性條件下Si-O-C鍵容易水解，且在干燥或熱處理過程中柱床易收縮和斷裂，限制了其應(yīng)用，能夠兼顧二者優(yōu)點(diǎn)，避其不足[8]。本文用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷、環(huán)氧樹脂三種反應(yīng)物質(zhì)，采用兩步催化溶膠-凝膠法制備了含有長(zhǎng)鏈有機(jī)結(jié)構(gòu)雙苯基雜化液相用整體柱，以該整體柱作為固相萃取柱，對(duì)尿樣中的倍他米松進(jìn)行了富集分析

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

主要儀器：P3000高效液相色譜儀（中國(guó)，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）； UV-3000紫外/可見分光檢測(cè)器（中國(guó)，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；色譜工作站CXTH-3000（北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；ODS C18柱（依利特，150mm × 4.6mm i.d.，5μm）；不銹鋼空色譜柱管（10mm× 4.6mm i.d.）；SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；HH-601 超級(jí)恒溫水?。ńK省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

四乙氧基硅烷（ TEOS 杭州硅寶化工有限公司）；γ-氨丙基三乙氧基硅烷（HG-550 杭州硅寶化工有限公司）；環(huán)氧樹脂（藍(lán)星新材料無錫樹脂廠）；泊洛沙姆（PF127天津一方科技有限公司）；乙醇（天津市進(jìn)豐化工有限公司）；鹽酸（天津永飛化工廠）；三乙胺（天津市福晨化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；尿液由健康志愿者提供。

1.2 有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱的制備

環(huán)氧樹脂1.5g，HG-550 2mL加入5 mL的塑料離心管中，超聲后混合均勻，通入氮?dú)?0min，將離心管密封，在25℃水浴中反應(yīng)3h。泊洛沙姆（PF127）0.0010 g、鹽酸 （0.2 mol/L）150μL、甲醇250μL、環(huán)氧樹脂和HG-550反應(yīng)后混合溶液190μL、四乙氧基硅烷240μL嚴(yán)格按照順序加入到10mL的塑料離心管中，超聲混合均勻后轉(zhuǎn)移到不銹鋼管中，密封，在60℃水浴4h，取出不銹鋼管在線加入三乙胺適量，密封，在60℃水浴12h。分別用甲醇和水將未反應(yīng)的物質(zhì)沖出，即得新型有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱。

1.3 樣品的制備

精密稱取適量的倍他米松標(biāo)準(zhǔn)品制備成為1.0g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)的儲(chǔ)備液稀釋成為0.01g/L中間儲(chǔ)備液，用于配制5～30mg/L尿液樣品（放于冰箱中保存）。

1.4 色譜條件

富集條件：整體柱（自制，10 mm ×4.6 mm）：流動(dòng)相：水、流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。分離的條件：C18柱（依利特，150mm × 4.6mm i.d.，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（60∶40，v/v）；流速：1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。

1.5 樣品處理與色譜分析

將自制整體柱連接在液相上，按照1.4富集條件，進(jìn)樣品5μL，待樣品走完，尿樣基本沖洗干凈后停泵，在整體柱的末端連接上C18柱，按照1.4分析條件進(jìn)行分析，分離整體柱上富集的倍他米松。

2 結(jié)果與討論

2.1 流速和壓力曲線

以甲醇為流動(dòng)相，測(cè)定整體柱的柱背壓，考察了整體柱柱背壓和流動(dòng)相流速之間的關(guān)系。該整體柱柱背壓較低，具有良好的通透性，柱背壓和流速呈良好的線性關(guān)系（r=0.99925）。

2.2 整體柱材料的表征

圖1是整體柱的電鏡掃描圖，從圖中可以看出整體柱具有大小不等的孔通道的網(wǎng)絡(luò)骨架結(jié)構(gòu)，整體柱具有良好的通透性。

圖1 SEM image of the cross sectional view of the monolithic column

2.3 整體柱的預(yù)處理能力

以水為流動(dòng)相將5μg/mL的倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液在254nm下分別進(jìn)樣于空柱管和整體柱，結(jié)果見圖2。然后分別將5μL的尿樣和5μL含有倍他米松的尿樣分別按照1.5進(jìn)行進(jìn)樣，所得的分離圖圖3。

圖2 the solution of Betamethasone injected into the empty tube (a)and monolithic column(b)

圖3 Chromatograms obtained from blank urine （a）and urine spiked with Betamethasone (b)

圖2可以看以水為流動(dòng)相時(shí)，在整體柱上進(jìn)樣時(shí)無色譜峰，說明倍他米松能很好的富集在整體柱上。從圖3中可以倍他米松在9.2min出峰，尿樣中無雜峰干擾測(cè)定，所以本實(shí)驗(yàn)制備的整體柱能夠在富集倍他米松的同時(shí)除去尿液中的其它成分，可以作為檢測(cè)尿中倍他米松的預(yù)處理柱。

2.4 方法驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液，用尿液稀釋成為質(zhì)量濃度為5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L系列的濃度梯度，按照1.5節(jié)的操作，每個(gè)濃度進(jìn)樣品3次。用所得色譜峰面積A對(duì)尿藥濃度C（μg/mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，回歸方程為標(biāo)準(zhǔn)曲線A=-1.61×104+1.89×104C，R=0.9994（n=6），在5～30mg/L范圍內(nèi)具有良倍他米松好的線性。當(dāng)儀器的信噪比為3時(shí)，測(cè)得倍他米松的檢測(cè)限6μg/L。

2.5.2 精密度與回收率

見表1。

表1 Precision accuracy and recovery of Betamethasone in urine sample

準(zhǔn)確配制倍他米松5mg/L、15mg/L、30 mg/L 三種濃度尿液樣品和同濃度的對(duì)照液各五份，尿液樣品按照1.5節(jié)的過程進(jìn)樣分析，對(duì)照液直接進(jìn)C18柱分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如上表，絕對(duì)回收率79.44%～ 83.03%之間，日內(nèi)、日間精密度均＜5.0%，精密度，準(zhǔn)確度良好，能滿足分析的要求。

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