段梅莉* 石 慧 吳海波 李 卉 黃麗瑛 李建其*

（1 華東理工大學(xué)，上海 200237；2 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200437）

骨質(zhì)增生引起的肩周炎等各種疼痛是中老年常見(jiàn)疑難病癥，尚無(wú)特效的西藥醫(yī)治，臨床常用的鎮(zhèn)痛藥有對(duì)乙酰氨基酚（撲熱息痛）、非甾體抗炎藥等緩解鎮(zhèn)痛病情的藥物[1]。雖有針灸、按摩牽引等療法，但存在復(fù)發(fā)率高的缺點(diǎn)[2,3]。由于中藥治療效果較好，近年來(lái)以中藥治療骨質(zhì)增生疼痛漸成主流[4-6]。

本文中治療骨質(zhì)增生疼痛的中藥方劑是以藥酒形式給藥[7]。該藥酒飲用量低（1～5mL/次），起效快，藥效高且持久。我們以藥酒為原料，濃縮后用溶劑萃取法分離其組成，對(duì)得到的各分離相進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性測(cè)試，并用HPLC、NMR圖譜對(duì)有較好活性的水相AD進(jìn)行鑒定分析。并且將相同中藥方劑的水提藥液濃縮，測(cè)試用溶劑萃取法得到的水相WP，通過(guò)該方劑藥酒和水提藥液鎮(zhèn)痛活性的比較，分析評(píng)價(jià)了它們之間的區(qū)別。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將中藥紅花、紫草、草烏、川烏、烏蛇、烏梅及雙花按照一定配比用高度白酒浸制而成藥酒；按照相同中藥配方，用水煎煮而成水提藥液；AR級(jí)無(wú)水乙醚，石英砂，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇，上海振興化工一廠；CP級(jí)正丁醇，上海菲達(dá)工貿(mào)公司。

1.2 分析方法和儀器

美國(guó)Waters 2795高效液相色譜儀，HPLC色譜柱為Xterra-C18（2.1×150mm，5μm），流動(dòng)相為0.05%TFA水溶液/0.05%TFA的乙腈溶液，樣品流速為0.2mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)光波長(zhǎng)247nm。德國(guó)BRUKER AVANCE 500超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振波譜儀，NMR樣品制備以D2O為溶劑。鎮(zhèn)痛活性采用醋酸扭體法和熱板法進(jìn)行測(cè)試。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

2.1 藥酒的濃縮分離

用白酒浸制的方劑藥液呈紫紅色透明狀液體。將500mL藥酒濃縮后得到6.0g的褐色黏稠膏狀物，加入200mL的蒸餾水?dāng)嚢?，按由低到高的極性順序用有機(jī)溶劑乙醚、氯仿和正丁醇逐級(jí)進(jìn)行萃取。各萃取相濃縮后的質(zhì)量及其含量百分比見(jiàn)表1，可明顯看出水相AD是藥酒中含量最高的一個(gè)組分，占總量的70%～80%。

表1 藥酒的溶劑萃取相含量百分比

2.2 藥酒分離相的鎮(zhèn)痛活性評(píng)價(jià)

藥酒經(jīng)溶劑萃取得到的乙醚相、氯仿相以及正丁醇相均難溶于水，采用灌胃給藥的方式進(jìn)行試驗(yàn)，水相采用皮下給藥的方式對(duì)小老鼠進(jìn)行了鎮(zhèn)痛活性試驗(yàn)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2、表3。結(jié)果顯示，氯仿相和正丁醇相均無(wú)鎮(zhèn)痛活性；乙醚相有鎮(zhèn)痛作用，但兼具致痛作用；藥酒中水相AD由表1可知是各萃取相中含量最多的組分，而且AD易溶于水，采用皮下給藥的方式對(duì)小老鼠進(jìn)行的鎮(zhèn)痛活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，AD在所測(cè)劑量范圍和給藥方式下對(duì)扭體法和熱板法的實(shí)驗(yàn)都有效，具有較好的鎮(zhèn)痛作用。因此，水相AD指紋圖譜的確定應(yīng)是藥酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的重點(diǎn)。

表2 扭體法測(cè)定各萃取相鎮(zhèn)痛活性的結(jié)果

表3 熱板法測(cè)定各萃取相鎮(zhèn)痛活性的結(jié)果

2.3 藥酒水相AD的HPLC分析

HPLC指紋圖譜分析選用Xterra-C18色譜柱，適用于強(qiáng)極性物質(zhì)的分離。為保證溶液的均一性，對(duì)每個(gè)樣品采取了兩次進(jìn)針的原則，得到的HPLC譜圖見(jiàn)圖1。浸制1個(gè)月和3個(gè)月的藥酒中水相樣品進(jìn)針后2～6min，10～12min，13～18min以及24min的出峰有4組，這些曲線基本保持一致，重復(fù)率高，穩(wěn)定性好。這些結(jié)果表明，HPLC的測(cè)定方法可以作為治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑的藥酒質(zhì)量評(píng)估指紋圖譜的分析。

圖1 藥酒水相AD（浸制1，3個(gè)月）的HPLC譜圖

2.4 藥酒水相AD的NMR分析

圖2 水相AD的1H-NMR譜圖

圖3 水相AD的13C-NMR譜圖

將AD經(jīng)短的硅膠柱（流動(dòng)相為95%的乙醇）過(guò)濾并濃縮后得到黃褐色黏稠狀的固形物。以D2O為溶劑制成褐色透明的NMR樣品，對(duì)AD的1H-NMR和13C-NMR譜圖分析分別如圖2和圖3所示。圖1中，主要吸收峰的化學(xué)位移多集中在3.2～3.8ppm（-CH2-OH、-CH2-OR）區(qū)域，還有少量位于1.1～1.4，1.8～2.2ppm區(qū)域的（烷基）吸收峰，幾乎未出現(xiàn)6～8ppm芳香烴類的特征峰。圖2中，吸收峰主要集中在60-80ppm（C-O、C-O-R）區(qū)域，還有7～8個(gè)中強(qiáng)峰位于80～150ppm區(qū)域。此外25～45ppm區(qū)域也有幾個(gè)弱的吸收峰，沒(méi)有出現(xiàn)180ppm以上的羰基、羧基等官能團(tuán)的特征峰。因此可基本排除水相AD中具有芳烴骨架的黃酮類、醌類以及脂肪酸等化合物的大量存在，推測(cè)水相AD組分中主要含有一些多糖-寡糖類化合物。

2.5 水提藥液的濃縮分離及其鎮(zhèn)痛活性評(píng)價(jià)

將與藥酒同等量的中草藥用傳統(tǒng)方法煎煮后過(guò)濾，得到了褐色的水提藥液。將水提藥液濃縮后得到3.2g的黑褐色固形物。加入200mL的蒸餾水，按由低到高的極性順序用有機(jī)溶劑乙醚和正丁醇逐級(jí)進(jìn)行萃取。各萃取相的質(zhì)量及其含量百分比見(jiàn)表4，可以看出，水相WP仍然是水提藥液中含量最高的一個(gè)組分，占總量的80%～90%。

表4 水提藥液的溶劑萃取相含量百分比

水相WP的鎮(zhèn)痛活性測(cè)試，只對(duì)扭體法實(shí)驗(yàn)有效，對(duì)熱板法無(wú)效。在所測(cè)劑量范圍和給藥方式下水相WP顯示了較弱的鎮(zhèn)痛活性，數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

表5 扭體法WP鎮(zhèn)痛活性的參數(shù)

3 小 結(jié)

治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑的藥酒，與方劑的水提藥液相比，前者濃縮物的重量大約是后者的兩倍。藥酒水相AD的質(zhì)量也大約是水提藥液水相WP的2倍，而且水相AD的鎮(zhèn)痛活性明顯高于水相WP。結(jié)果說(shuō)明治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑的藥酒，從鎮(zhèn)痛活性有效成分的含量和藥用效果來(lái)看，都明顯優(yōu)于水提藥液。因此治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑的配制，應(yīng)以高度白酒浸制為基準(zhǔn)，不能以水替酒。

通過(guò)不同浸制時(shí)間藥酒水相AD的HPLC譜圖曲線對(duì)比，曲線基本保持一致，重復(fù)率高，穩(wěn)定性好，表明用HPLC再輔以操作簡(jiǎn)便的IR指紋圖譜分析可以成為治療骨質(zhì)增生疼痛中藥方劑藥酒的質(zhì)量檢測(cè)方法。

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