劉文偉 張雪燕 習(xí) 靜 韓躍武

蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研所，甘肅蘭州 730000

診斷慢性粒細(xì)胞白血病的電化學(xué)生物傳感器的研究

劉文偉 張雪燕 習(xí) 靜 韓躍武

蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研所，甘肅蘭州 730000

目的 建立一種檢測慢性粒細(xì)胞白血病的方法。 方法 此實驗在已經(jīng)篩選出慢性粒細(xì)胞白血病（CML）K562細(xì)胞5個特異性、結(jié)合率較高的核酸適體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種檢測方法：采用兩種納米金屬材料分別標(biāo)記5個適體，將標(biāo)記后的10個適體，兩兩組合與CML K562同時結(jié)合，一個作為捕獲分子，一個作為測定分子與CML K562結(jié)合后，經(jīng)氧化還原反應(yīng)將測定分子上的金屬轉(zhuǎn)化成離子狀態(tài)，利用電化學(xué)工作站檢測對應(yīng)的電流。 結(jié)果 篩選出了最佳組合（P2-S3-P1-S5）實現(xiàn)對CML K562的檢測，得到了檢測細(xì)胞數(shù)目與DPV電流值的擬合曲線方程。 結(jié)論 得到一種檢測下限可達(dá)到50個細(xì)胞的診斷慢性粒細(xì)胞白血病的電化學(xué)生物傳感器。

核酸適體；納米材料；CML K562；電化學(xué)生物傳感器

目前以適體作為識別元件的生物傳感器有光學(xué)適體生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器、壓電石英晶體生物傳感器[1-4]。SELEX技術(shù)自問世已有20多年的發(fā)展歷程，光學(xué)適體生物傳感器和壓電石英晶體生物傳感器已相繼有商品，但適體電化學(xué)傳感器的研究還處于起步階段，其中早期診斷慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）的電化學(xué)生物傳感器也是一個空缺。筆者采用兩種納米材料分別標(biāo)記5個適體，兩兩組合，一個作為捕獲分子，一個作為測定分子與CML K562結(jié)合后，經(jīng)氧化還原反應(yīng)將測定分子上的金屬轉(zhuǎn)化成離子狀態(tài)，利用電化學(xué)工作站檢測電流[5-10]，篩選出最佳組合，結(jié)合適體與CML K562的結(jié)合率，可以判斷結(jié)合的CML K562的數(shù)量，得到一種操作簡單、靈敏度高、快速的早期診斷慢性粒細(xì)胞白血病的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI1210A電化學(xué)分析儀（CHI公司，美國）、原子吸收分光光度計、德國耶拿原子吸收光譜儀，型號ZEEnit700。

質(zhì)粒抽提、PCR等試劑盒、100 bp DNA marker、胎牛血清（上海生工生物技術(shù)有限公司）生物素-鏈霉親合素磁珠及磁力架、8種引物（上海生工生物技術(shù)有限公司）分別為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8：帶羧基磁性納米顆粒（平均粒徑為30 nm）（巴溪儀器有限公司）；四氯金酸溶液（HAuCl4，上海中秦化學(xué)試劑有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 用氨基標(biāo)記核酸適體 S1、S2、S3、S4、S5

根據(jù)ssDNA適體的序列選擇各適體需要的上、下游引物經(jīng)PCR擴(kuò)增成5'端標(biāo)記氨基和生物素的雙鏈DNA。用生物素-鏈霉親和素磁珠的方法分離，獲得5'端標(biāo)記氨基適體[4]。

1.2.2 用巰基標(biāo)記核酸適體 S1、S2、S3、S4、S5

根據(jù)ssDNA適體的序列選擇各適體上、下游引物經(jīng)PCR擴(kuò)增成5'端標(biāo)記巰基和生物素的雙鏈DNA。用生物素-鏈霉親和素磁珠的方法分離，獲得5'端標(biāo)記巰基適體。

1.2.3 在磁性納米粒子上固定標(biāo)記氨基的核酸適體Ⅰ

將50 μL的帶羧基的磁性納米粒子用PBS緩沖溶液（pH=7.3）洗滌 5 次（500 μL/次）、5'端標(biāo)記氨基的核酸適體40 μL，加入5 mg咪唑，超聲 30 min，室溫下放置 12 h。 利用磁鐵分離，分3次用600 μL PBS溶液洗滌沉淀，洗去過量的核酸適配體Ⅰ，將最終的沉淀（納米粒子上固定有核酸適體Ⅰ）分散在 500 μL PBS 緩沖溶液中，4℃冷藏[11]。

1.2.4 巰基標(biāo)記核酸適體Ⅱ金膠探針的制備

1.2.4.1 金膠溶液的制備 參照文獻(xiàn)[2]制備金膠溶液：所用器皿均用王水浸泡過夜，用三蒸水沖洗。將HAuCl4配制成0.01%水溶液，將1.1 mg HAuCl4溶于11 mL三蒸水，過0.22 μm的濾膜。將檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）配制成1%水溶液，將0.1 g檸檬酸三鈉溶于10 mL三蒸水，過0.22 μm的濾膜。取10 mL 0.01%HAuCl4煮沸，邊攪動邊準(zhǔn)確加入250 μL的1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。在沸騰狀態(tài)攪拌15～30 min。不加熱情況下再攪拌10 min。冷卻至室溫，用蒸餾水定容至原體積。置于棕色瓶內(nèi)4℃保存，數(shù)月有效[12]。

1.2.4.2 巰基標(biāo)記核酸適體Ⅱ金膠探針制備結(jié)合比例的確定用3 mL的金膠溶液溶解30、40、50 μL的巰基標(biāo)記核酸適體Ⅱ，室溫靜置24 h，讓核酸適配體Ⅱ中的巰基與金膠充分結(jié)合，然后將此溶液在15 000 r/min條件下，離心25 min，分離后收集上清液。用500 μL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH=7.3）沖洗沉淀物3次，反復(fù)離心，收集上清液（除去過量的核酸適體），合并上清液，在260 nm處測定吸光度（圖1）。

由圖1可知，用40、50 μL含巰基的核酸適體與3 mL金膠溶液制備的金膠探針，在260 nm處有吸光度、用30 μL含巰基的核酸適體與3 mL金膠溶液制備的金膠探針，在260 nm處無明顯吸光度，說明40 μL以上比例的巰基標(biāo)記核酸適體溶解于3 mL的金膠溶液制備金膠探針時，可確保巰基標(biāo)記核酸適體Ⅱ過量。

1.2.4.3 巰基標(biāo)記核酸適體Ⅱ金膠探針的制備 用3 mL的金膠溶液溶解40 μL的巰基標(biāo)記核酸適體Ⅱ用上述方法制備金膠探針，將離心后的沉淀，加入500 μL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH=7.3）稀釋成一定濃度，4℃低溫冷藏。

1.2.5 CMLK562的特異性識別與分離

用含10%小牛血清的RPMI-1640的培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞計數(shù)濃度為5×105/mL左右，20 pmoL的納米粒子上固定有核酸適體Ⅰ懸浮液[9]，將 10 μL 的 PBS（1.5 mmol/L，pH=7.4）溶液和20 pmoL核酸適體Ⅱ的金膠探針置于自制的反應(yīng)池中，加入20 μL的K562細(xì)胞溶液，在室溫下識別結(jié)合20 min。K562細(xì)胞與核酸適配體Ⅰ和Ⅱ特異性結(jié)合形成含有磁性顆粒和納米金的復(fù)合結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。然后，把電極放在一塊磁鐵上，將上述液體滴加在工作電極上，待三明治結(jié)構(gòu)吸附在工作電極后，1～2 min，吸棄溶液，在磁場作用下，用PBS緩沖溶液沖洗幾次，分離沉淀，除去未結(jié)合的多余的適體或細(xì)胞液[14]。最后含復(fù)合結(jié)構(gòu)的磁性顆粒吸附在電極表面待測定電流。

1.2.6 檢測電化學(xué)

1.2.6.1 兩種納米粒子標(biāo)記的核酸適體兩兩組合后最佳配對的篩選 將吸有復(fù)合結(jié)構(gòu)的磁性顆粒的電極放于磁鐵，將0.1 mol/L鹽酸溶液20 μL滴加在工作電極上，注意液滴覆蓋工作電極、參比電極和輔助電極。用+1.25 V恒電位預(yù)氧化150 s，使金膠探針中的金原子氧化成Au3+離子，立即進(jìn)行反向陰極掃描，獲得Au3+電化學(xué)還原的差分脈沖伏安（DPSV）曲線[15]。從此圖可知金膠探針的特征電化學(xué)還原峰在+0.45 V（vs.Ag/AgCl），有兩組適體的配對產(chǎn)生的電流非常明顯，證明此組為最佳組合（P2-S3-P1-S5）。

1.2.6.2 適體檢測方法靈敏度及檢測限的測定 將篩選出的最佳組合的適體組（P2-S3-P1-S5），分別取20 pmoL按照上述實驗方法1.2.5和1.2.6，分別檢測不同數(shù)量的K562細(xì)胞。見圖2。

圖2以細(xì)胞數(shù)目為橫坐標(biāo)，DPV電流值為縱坐標(biāo)，利用SigmaPlot 10.0軟件做非線性回歸分析結(jié)果，擬合曲線方程為：Y=-0.205X/（62.73+X）， 其中 X 為細(xì)胞數(shù)目，Y 為 DPV電流值。如圖2所示，對慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的最低檢測限是50個細(xì)胞。隨著細(xì)胞數(shù)目的增加，DPV電流值增加，隨后待適體均被結(jié)合以后基本到達(dá)一個平臺，不再隨著細(xì)胞數(shù)目的增加而增加。對樣品重復(fù)測定10次，測得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.78%。

2 結(jié)果

本文建立了一種用兩種金屬元素標(biāo)記核酸適體，然后讓兩種標(biāo)志物的核酸適體分別或兩兩組合后同時與靶物質(zhì)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞結(jié)合分離后，分別測定金屬含量并比較前后變化，判斷出兩個核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)不同。然后用納米金為電化學(xué)活性物質(zhì)，篩選出最佳組合（P2-S3-P1-S5），制備了早期診斷慢性粒細(xì)胞白血病的電化學(xué)生物傳感器。此種方法操作簡單，檢測靈敏度高，即使細(xì)胞數(shù)目為50個也能檢測出。

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病是一種影響血液及骨髓的惡性腫瘤。主要的診斷方法有血象、骨髓象、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶檢測（NAP）、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測、分子遺傳學(xué)檢測等。然而，目前的分子診斷技術(shù)要求高，靈敏度不高，還無法在腫瘤發(fā)生的早期進(jìn)行診斷，所以白血病的早期診斷是個亟待解決的問題。

隨著慢粒早期診斷研究的不斷深入，結(jié)合核酸適配子的特性，本實驗在研究了大量的核酸適體、核酸適體生物傳感器、核酸適體電化學(xué)生物傳感器相關(guān)報道的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實驗室已經(jīng)篩選出的5個結(jié)合率高于40%的慢性粒細(xì)胞白血病適體，利用核酸適體易于標(biāo)記的特點(diǎn)，結(jié)和膠體金技術(shù)，磁性納米粒子兩種納米材料、電化學(xué)檢測技術(shù)，用帶羧基的磁性納米粒子的已經(jīng)標(biāo)記有氨基的5個ssDNA核酸適配子和膠體金標(biāo)記了巰基的5個ssDNA核酸適配子兩兩組合的適體，一個作為捕獲分子，一個作為測定分子與CML K562結(jié)合后，利用磁鐵將結(jié)合物固定在三電極系統(tǒng)分別為：玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲網(wǎng)輔助電極的絲網(wǎng)印刷電極傳感器，經(jīng)氧化還原反應(yīng)將電極上的金原子轉(zhuǎn)化成離子狀態(tài)，利用電化學(xué)工作站檢測對應(yīng)的電流，篩選出最佳組合。利用最佳組合適體對與不同數(shù)量的CML K562結(jié)合，通過檢測到的電流與CML K562的數(shù)量關(guān)系式，利用軟件做非線性回歸分析結(jié)果得到擬合曲線方程：Y=－0.205X/（62.73+X），其中X為細(xì)胞數(shù)目，Y為DPV電流值。對慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞的最低檢測限可達(dá)到50個細(xì)胞。隨著細(xì)胞數(shù)目的增加，DPV電流值增加，隨后待適體均被結(jié)合以后基本到達(dá)一個平臺，不再隨著細(xì)胞數(shù)目的增加而增加。對樣品重復(fù)測定10次，測得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.78%，從而得到一種操作簡單、靈敏度高、快速的早期診斷慢性粒細(xì)胞白血病的方法。

[1]Liss M，Petersen B，Wolf H，et al.An aptamer-based quartz crystal protein biosensor[J].Anal Chem，2002，74（17）：4488-4495.

[2]Kang WJ，Chae JR，Cho YL，et al.Multiplex imaging of single tumor cells using quantum-dot-conjugated aptamers[J].Small，2009，5：2519-2522.

[3]Wang J，Jiang M.Dendritic Nucleic Acid Probes for DNA Biosensors[J].J Am Chem Soc，1998，120：8281-8282.

[4]Kazunori I，Chiharu K，Koji S.Novel electrochemical sensor system for protein using the aptamers in sandwich manner[J].Biosens Bioelectron，2005，20（10）：2168-2172.

[5]ChenHW，MedleyCD，SefahK，etal.Molecularrecognitionofsmall-cell lung cancer cells using aptamers[J].Chem Med Chem，2008，3：991-1001.

[6]Sefah K，Tang ZW，Shangguan DH，et al.Molecular recognition of acute myeloid leukemia using aptamers[J].Leukemia，2009，23：235-244.

[7]Zheng J，F(xiàn)eng W，Lin L，et al.A new amplification strategy for ultrasensitive electrochemical aptasensor with network-like thiocyanuric acid/gold nanoparticles[J].Biosens Bioelectron，2007，23：341-347.

[8]張艷麗，朱靜，周敬良，等.適體電化學(xué)傳感器的研究進(jìn)展[J].化學(xué)傳感器，2008，28（3）：1-6.

[9]劉玲玲，韓躍武，李真真，等.慢性髓細(xì)胞性白血病靶細(xì)胞適體的篩選與鑒定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009，30：1157-1160.

[10]韓躍武，劉玲玲，姚海燕，等.檢測慢性粒細(xì)胞性白血病的單鏈DNA適配子及其制備方法：中國，200910117587[P].2010-06-23.

[11]Maxwell DJ，Taylor JR，Nie S.Self-assembled nanoparticle probes for recognition and detection of biomolecules[J].J Am Chem Soc，2002，124（32）：9606-9612.

[12]Pumera M，Castaneda MT，Pividori MI，et al.Magnetically triggered direct electrochemical detection of DNA hybridization using Au67 quantum dots as electrical tracer[J].Langmuir，2005，21（21）：9625-9629.

[13]Cai H，Xu Y，He PG，et al.Colloid au-enhanced DNA immobilization for the electrochemical detection of sequence-specific DNA[J].J Electroanal Chem，2001，510（1）：78-85.

[14]Pavlov V，Xiao Y，Shlyahovsky B，et al.Aptamer-functionalized au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin [J].J Am Chem Soc，2004，126（38）：11768-11769.

[15]Deisingh AK.Aptamer-based biosensors：biomedical applications[J].Handb Exp Pharmacol，2006，8：341-357.

Study of electrochemical biosensor for diagnosis chronic myeloid leukemia

LIU WenweiZHANG Xueyan XI JingHAN Yuewu
Research Institute of Biochemistry,School of Basic Medical Science,Lanzhou University,Gansu Province,Lanzhou 730000,China

Objective To creat a method of detection for chronic myelocytic leukemia.Methods A method of detection had been built,based on an experiment in lab,during which,5 highly-combined aptamers of CML K562 cells had been selected.Five aptamers were marked with two kinds of nanoparticles separately.The ten marked aptamers were divided into 20 pairs by every two combination.In every pair,the aptamers,one as the capture molecules,the other the determination molecules,were combined with CML K562 cells.Then the Au atoms were transformed into the state of Au-ion by REDOX reactions and electric current was sensed by electrochemical detection.Results The best pair of aptamers was selected to detecte CML K562,the fitted curve equation to test cells number and DPV of current value was obtained.Conclusion Get a electrochemical biosensor which can be used to diagnose CML K562 cells,with a detection limit up to 50 cells.

Aptamers;Nanoparticles;CML K562;Electrochemical biosensor

R557

A

1673-7210（2012）08（b）-0014-03

2012-03-14 本文編輯：張瑜杰）