盛衛(wèi)國(guó) 葉劍鋒 徐 勇 吳 健 馬麗萍 王如偉

浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310052

紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定普樂(lè)安片中總甾醇含量

盛衛(wèi)國(guó) 葉劍鋒 徐 勇 吳 健 馬麗萍 王如偉

浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310052

目的 建立紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定普樂(lè)安片中總甾醇的含量測(cè)定方法。 方法 以β-谷甾醇為對(duì)照品，通過(guò)香草醛-高氯酸顯色反應(yīng)，測(cè)定普樂(lè)安片中總甾醇的含量。 結(jié)果 對(duì)照品和樣品最大吸收波長(zhǎng)均在542 nm，對(duì)照品β-谷甾醇在0.030 39～0.081 04 mg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，r=0.998 8，樣品平均回收率為100.6%，RSD=2.75%。結(jié)論 本法測(cè)定總甾醇含量準(zhǔn)確、靈敏，重現(xiàn)性好，可用于測(cè)定普樂(lè)安片中總甾醇含量，為普樂(lè)安片質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

紫外-可見(jiàn)分光光度法；β-谷甾醇；普樂(lè)安片；總甾醇；含量測(cè)定

普樂(lè)安片是以油菜蜂花粉為原料制成的片劑，具有補(bǔ)腎固本的功能，主治腎氣虧虛所致的腰膝酸軟，尿后余瀝或不禁，臨床用于前列腺增生和慢性前列腺炎的治療，療效確切，安全性高。目前研究結(jié)果顯示[1-5]，植物甾醇可以很大程度地改善良性前列腺增生（BPH）患者泌尿系統(tǒng)癥狀，對(duì)抑制前列腺肥大和改善膀胱收縮均有明顯效果。油菜花粉中總甾醇含量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道，本法通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定普樂(lè)安片中總甾醇含量，為提升普樂(lè)安片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供可靠依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2201紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；AX205分析天平（METTLER TOLEDO公司）；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）。

1.2 試藥

普樂(lè)安片（浙江康恩貝制藥股份有限公司）；β-谷甾醇對(duì)照品（上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，供含量測(cè)定用，批號(hào)：16-2001），高氯酸、香草醛、冰醋酸、氯仿等試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取β-谷甾醇對(duì)照品10.13 mg于10 mL量瓶中，加三氯甲烷適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密移取1.0 mL于10 mL量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，即得，濃度為0.101 3 mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

取普樂(lè)安片若干，用潤(rùn)濕的潔凈紗布小心擦去表面薄膜衣層，70℃減壓干燥2 h，置研缽中研磨成粉，過(guò)80目篩，稱(chēng)取本品0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL氯仿，密塞稱(chēng)定重量，超聲處理60 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用氯仿補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)。精密移取續(xù)濾液10 mL于燒瓶中，減壓蒸干，加入20 mL 10%氫氧化鈉-乙醇溶液，95℃水浴回流2 h，放冷，加入40 mL蒸餾水，振搖，混勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用正己烷萃取3次，每次20 mL，合并正己烷萃取液，用蒸餾水洗滌正己烷液2次，每次40 mL，棄去水層，正己烷層減壓回收至適當(dāng)體積后，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用適量正己烷洗滌燒瓶，洗滌液并入量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 測(cè)定條件的選擇

2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密移取0.5 mL β-谷甾醇對(duì)照品溶液、1.0 mL供試品溶液于10 mL具塞玻璃管中，85℃水浴揮盡溶劑，加入0.6 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，密塞，70℃水浴保溫30 min，取出，流水迅速冷卻至室溫，精密加入冰醋酸4.6 mL，搖勻，隨行試劑作空白，在190～900 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，對(duì)照品和供試品溶液均在在542 nm有最大吸收峰，故選擇542 nm為總甾醇含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2 顯色條件的選擇

2.3.2.1 顯色反應(yīng)正交設(shè)計(jì) 采用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選顯色條件，正交因素水平表設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 顯色條件正交設(shè)計(jì)因素水平表

精密移取0.5 mL β-谷甾醇對(duì)照品溶液于10 mL具塞玻璃試管中，85℃水浴揮盡溶劑，加入不同用量5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，密塞，70℃水浴保溫30 min，取出，流水迅速冷卻至室溫，精密加入不同用量冰醋酸，使溶液體積為6.0 mL，搖勻，隨行試劑作空白，在542 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 顯色反應(yīng)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由表2可見(jiàn)，直觀分析顯示各因素對(duì)顯色反應(yīng)吸光度的作用主次為A>C>B，最佳顯色條件為A3B3C3；方差分析結(jié)果表明A因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B(niǎo)、C因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；由于顯色溫度對(duì)吸光度無(wú)顯著影響，考慮供試品穩(wěn)定性，顯色溫度70℃為佳。

2.3.2.2 高氯酸用量的選擇 參考文獻(xiàn)報(bào)道，高氯酸用量對(duì)顯色反應(yīng)有較大影響，故在已選定的顯色條件下，以β-谷甾醇對(duì)照品制備供試品溶液，單獨(dú)考察不同高氯酸用量對(duì)顯色反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，隨著高氯酸用量增加，吸光度增加，當(dāng)用量為1.2 mL時(shí)，吸光度出現(xiàn)下降；用量為0.4 mL時(shí)，λmax為545 nm，用量為1.0 mL時(shí)，λmax為541 nm，可見(jiàn)不同高氯酸用量可引起最大吸收波長(zhǎng)及吸光度的變化，考慮對(duì)照品和供試品最大吸收波長(zhǎng)的一致性以及供試品的穩(wěn)定性，高氯酸用量以0.8 mL為宜。

綜上所述，總甾醇最佳顯色條件為：精密移取適量對(duì)照品溶液、供試品溶液于10 mL具塞玻璃試管中，85℃水浴揮盡溶劑，加入0.6 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，密塞，70℃水浴保溫30 min，取出，流水迅速冷卻至室溫，精密加入冰醋酸4.6 mL，搖勻，隨行試劑作空白，于542 nm測(cè)定吸光度。

2.3.2.3 顯色穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取0.5 mL β-谷甾醇對(duì)照品溶液、1.0 mL供試品溶液于10 mL具塞玻璃試管中，自“85℃水浴揮盡溶劑”起，按確定的顯色條件進(jìn)行顯色，分別于顯色結(jié)束 10、15、20、25、30 min 測(cè)定對(duì)照品和供試品吸光度變化，結(jié)果表明對(duì)照品和供試品在30 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。

2.4 總甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精密移取0.101 3 mg/mL的β-谷甾醇對(duì)照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 于 10 mL 具塞玻璃試管中， 自“85℃水浴揮盡溶劑”起，按確定的顯色條件進(jìn)行顯色和測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量和吸收值進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程Y=-0.062 08+11.033 7 X，r=0.998 8，表明 β-谷甾醇在 0.030 39～0.081 04 mg線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

按供試品溶液的制備方法，自“稱(chēng)取本品0.5 g”起制備供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、6、8 h 各精密移取 1.0 mL 于10 mL具塞玻璃試管中，自“85℃水浴揮盡溶劑”起，按確定的顯色條件進(jìn)行顯色和測(cè)定，測(cè)得不同時(shí)間供試品溶液中β-谷甾醇含量見(jiàn)表4，RSD=2.33%，說(shuō)明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

表4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 重復(fù)性

取普樂(lè)安片適量（批號(hào)：090220），按上述含量測(cè)定方法制備6份供試品溶液，測(cè)得總甾醇的含量分別為2.70%、2.66%、2.64%、2.79%、2.61%、2.70%，平均含量為 2.68%，RSD=2.36%，表明其重復(fù)性良好。

2.6.2 中間精密度

取普樂(lè)安片適量（批號(hào)：090220），按上述含量測(cè)定方法，于數(shù)天內(nèi)測(cè)定總甾醇含量，分別為2.64%、2.68%、2.71%、2.71%、2.57%、2.55%，平均含量 2.64%，RSD=2.64%，中間精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取普樂(lè)安片適量（批號(hào)：090220），按供試品溶液的制備方法，稱(chēng)取6份，每份0.25 g，精密稱(chēng)定，精密加入β-谷甾醇對(duì)照品溶液（含β-谷甾醇6.626 mg），自“精密加入50 mL氯仿”起，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按確定的顯色條件進(jìn)行顯色和測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5，表明本法回收率符合要求。

2.8 普樂(lè)安片中總甾醇含量測(cè)定

取5批不同批號(hào)的普樂(lè)安片，按上述含量測(cè)定方法測(cè)定總甾醇含量，結(jié)果分別為2.44%、2.43%、2.49%、2.46%、2.48%。

表5 總甾醇加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 樣品溶液的皂化處理

樣品溶液如果不進(jìn)行皂化處理直接按顯色條件進(jìn)行顯色，其最大吸收峰在537 nm，與對(duì)照品最大吸收峰542 nm相差較大，不符合《中國(guó)藥典》2005年版附錄ⅤA[6]紫外-可見(jiàn)分光光度法對(duì)供試品溶液吸收峰波長(zhǎng)的規(guī)定。樣品經(jīng)皂化處理后，吸收峰波長(zhǎng)與對(duì)照品最大吸收峰波長(zhǎng)一致，符合規(guī)定，故樣品需進(jìn)行皂化處理。

3.2 顯色方法的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇了Liebermann反應(yīng)、改良Liebermann-Burchard試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，但樣品、對(duì)照品均存在吸光度變化快，無(wú)明顯的顯色穩(wěn)定時(shí)間，故不適合作為本樣品甾醇顯色方法，香草醛-高氯酸反應(yīng)靈敏度高，顯色穩(wěn)定，適合作為甾醇含量測(cè)定的顯色反應(yīng)。

[1]Coleman CI，Hebert JH，Reddy P，et al．The efect of phytosterols on quality of life in the treatment of benign prostatic hyperplasia[J]．Pharmacother，2002，22（11）：1426-1432．

[2]程麗艷，鄭曉亮，屠凌嵐，等，植物甾醇對(duì)非細(xì)菌性前列腺炎治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，9（15）：991-996.

[3]趙國(guó)志，劉喜亮，劉智鋒.植物甾醇及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用（下）[J].糧食與油脂，2006，（3）：3-8.

[4]徐卓云.植物類(lèi)制劑治療良性前列腺增生的作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（5）：41-43．

[5]韓軍花.植物甾醇的性質(zhì)、功能及應(yīng)用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2001，28（5）：285-287．

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄28.

Quantitative determination of total sterol in Pule'an Tablets by UV spectrophotometry

SHENG WeiguoYE JianfengXU YongWU Jian MA LipingWANG Ruwei
Zhejiang Modern Chinese Medicine and Natural Drug Research Academy Co.,LTD.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacecutical Technology,Zhejiang Province,Hangzhou 310052,China

Objective To establish the determination method of total sterol in Pule'an Tablets by UV spectrophotometry.Methods The determination was performed by using β-sitosterol as control substance.Through the vanillin-high chlorine acid color reaction,the content of total sterols in Pule'an Tablets were determined.Results The absorption wavelength of reference substance and sample maximum were both in the 542 nm.The absorbency and quality of β-sitosterol have good linearity in the range of 0.030 39-0.081 04 mg (r=0.998 8).The average recovery rate was 100.6%with RSD=2.75%.Conclusion The method is simple,highly accurate,reproducible,and can be applied to the determination of total sterol in Pule'an Tablets.

UV Spectrophotometry;β-sitosterol;Pule'an Tablets;Total sterol;Content determination

R285.5

A

1673-7210（2012）08（b）-0008-03

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2009E10009）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：20061921N01）。

盛衛(wèi)國(guó)（1972-），男，博士，工程師；研究方向：藥物制劑新劑型與新技術(shù)。

王如偉，高級(jí)工程師，博士生導(dǎo)師。

2012-02-16 本文編輯：衛(wèi) 軻）