翁育偉，張長(zhǎng)弓，王金章，林梅清，黃 萌，嚴(yán)延生

2.福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001；

3.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福州 350004；

4.廈門波生生物技術(shù)有限公司，廈門 361000

登革熱（dengue fever，DF）是一種由媒介傳播的病毒性傳染病。在過(guò)去的50年間，隨著登革熱在全球迅速擴(kuò)散，登革熱的發(fā)病率上升了30倍。據(jù)估計(jì)，目前全球每年約有5千萬(wàn)人感染登革病毒。在全球，登革熱流行區(qū)域已經(jīng)波及到熱帶、亞熱帶100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。近年來(lái)，隨著對(duì)外經(jīng)貿(mào)、旅游的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)報(bào)告輸入性登革熱病例也不斷增加，在東南沿海省份，還不時(shí)發(fā)生由輸入性病例導(dǎo)致的登革熱暴發(fā)流行［2－4］。鑒于登革熱的流行態(tài)勢(shì)及其潛在危害，我國(guó)已將登革熱列為重點(diǎn)防控的傳染病之一。

疫苗是預(yù)防和控制登革熱最有效的手段，但截至目前，全球尚無(wú)登革熱疫苗面市。因此，快速可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)在登革熱診斷、治療以及DF的預(yù)防控制中具有重要的作用。登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括登革病毒分離、病毒核酸檢測(cè)以及病毒抗體或抗體的血清學(xué)檢測(cè)等，但幾種方法各有局限性［1］。比如，病毒分離是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要較長(zhǎng)的檢測(cè)周期且檢測(cè)的敏感性不高，病毒核酸雖然具有敏感性、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)設(shè)備和檢測(cè)人員的素質(zhì)要求較高。登革熱的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)還受病程的影響，根據(jù)發(fā)病后不同的時(shí)期，需采用不同的檢測(cè)方法。相對(duì)于恢復(fù)期病例而言，急性期病例的診斷對(duì)登革熱治療、預(yù)防和控制更為重要。在幾種登革病毒診斷方法中，基于膠體金標(biāo)記的免疫層析檢測(cè)法（immuno－chromatography test）因具有簡(jiǎn)便、快速、無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備、人員要求不高等特點(diǎn)，除適合于實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展常規(guī)抗體檢測(cè)外，在暴發(fā)疫情的現(xiàn)場(chǎng)處置中更是具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。但截至目前，除國(guó)外主要試劑生產(chǎn)商有此類試劑面市外，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有類似試劑上市并應(yīng)用于檢測(cè)工作中。在本研究中，我們利用在大腸桿菌中表達(dá)并具有免疫活性的1－4型登革病毒的外膜重組蛋白［5］，組裝膠體金免疫 層 析 試 紙 條 （immuno－chromatography strip，ICS），利用采集自備的血清盤，初步分析該試劑的檢測(cè)效果。

1 材料與方法

1.1 材料 登革病毒1－4型重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備［5］。登革病毒IgM抗體膠體金試紙條由廈門波生生物技術(shù)有限公司組裝，其中血清型特異性膜條使用單一型別重組抗原組裝，通用膜條的使用4種重組抗原混合組裝。對(duì)照試劑采用IgM抗體捕獲法檢測(cè)試劑（Dengue IgM capture ELISA，澳大利亞Panbio公司），測(cè)試用陽(yáng)性血清采集自登革病毒感染者，陰性血清采集自健康體檢者，瘧疾、鉤端等其它傳染病患者急性期血清為本室保存。病毒核酸抽提及RT－PCR試劑購(gòu)置QIAGEN公司，Ex Taq酶、DNA marker等購(gòu)自TaKaRa公司（大連）。

1.2 方法

1.2.1 血清樣品的采集和保存 使用無(wú)抗凝劑的真空采血管采集登革病毒感染者外周血，室溫放置1h后，1 000r/min離心10min，收集血清，置于－20℃保存?zhèn)溆谩Ｆ渲械歉?型感染者血清采集自2004年福建省登革熱暴發(fā)［2］病例（除1例散發(fā)病例外）；登革2型感染者血清分采集自2007年福建省登革熱暴發(fā)［3］期間的病例；登革3型和4型病毒感染者血清采集自2004－2012年間福建省發(fā)現(xiàn)的輸入性散發(fā)病例，所有陽(yáng)性血清均經(jīng)IgM抗體捕獲法ELISA證實(shí)。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料，所有病毒感染者均為初次感染，無(wú)2次感染病例。對(duì)照血清采集自健康體檢者血清。測(cè)試用血清樣品情況見(jiàn)表1。

表1 本研究使用的血清樣品Tab.1 Composition of serum panel used in this study

1.2.2 病毒型別鑒定 取140μL急性期（發(fā)病至采樣時(shí)間≤7d）血清，按RNA mini kit（QIAGEN）說(shuō)明書提取病毒核酸，按Lanciotti等［6］方法做反轉(zhuǎn)錄套式PCR，根據(jù)病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果判定病毒型別。部分病例血清為≥7d的恢復(fù)期血清，其型別根據(jù)配對(duì)的急性期血清的RT－PCR結(jié)果判定。

1.2.3 IgM 抗體捕 獲法 ELISA（IgM antibody capture ELISA，Mac ELISA）檢測(cè) 采用Panbio公司的Dengue IgM Capture ELISA試劑，按試劑說(shuō)明書操作檢測(cè)血清樣品中的IgM抗體，其中，Index value＞1.1者判為陽(yáng)性，≤1.1者判為陰性。

1.2.4 膠體金免疫層析法檢測(cè) 登革病毒IgM膠體金免疫層析試紙條由廈門波生生物技術(shù)有限公司組裝，按說(shuō)明書操作。其中，對(duì)照線和檢測(cè)線同時(shí)顯色判為陽(yáng)性，僅對(duì)照線顯色判為陰性，對(duì)照線不顯色則判為實(shí)驗(yàn)無(wú)效。結(jié)果觀察在15min內(nèi)完成。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 兩種檢測(cè)方法結(jié)果的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，檢測(cè)方法一致性采用Kappa分析。

2 結(jié) 果

2.1 通用型ICS檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用4種血清型混合抗原組裝的通用型ICS的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。在Mac ELISA檢測(cè)陽(yáng)性的69份標(biāo)本中，ICS檢出陽(yáng)性59份，Mac ELISA檢測(cè)陰性的111份標(biāo)本中，ICS檢出陽(yáng)性104份。以Mac－ELISA為參照，ICS的敏感性為85.5%（59/69），特異性為93.7%（104/111）。ICS與Mac ELISA兩種檢測(cè)方法的符合率為90.56%，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的配對(duì)χ2檢驗(yàn)表明，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.629），兩種檢測(cè)方法具有較高的一致性（Kappa＝0.799）。

2.2 分型ICS檢測(cè)結(jié)果 自血清盤中篩選 Mac ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性且RT－PCR結(jié)果陽(yáng)性的血清標(biāo)本28份，其中D1、D2型各10份，D3型7份，D4型1份。應(yīng)用各型抗原單獨(dú)組裝的試紙條檢測(cè)IgM抗體，分型檢測(cè)結(jié)果表明，ICS型內(nèi)IgM的檢測(cè)陽(yáng)性率為42.9%～100%，而非對(duì)應(yīng)型別的抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為0%～33.3%。除D1型外，其它各型ICT均可檢出對(duì)非對(duì)應(yīng)型別的IgM，表明分型ICS具有型間交叉反應(yīng)。

2.3 通用ICS檢測(cè)其它病原體感染者血清 在180份血清中，有33份為其它方法確診的流行性出血熱（n＝13）、鉤端螺旋體（n＝8）、恙蟲(chóng)?。╪＝8）、瘧疾（n＝4）患者血清標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)分析通用型ICS和Mac ELISA方法測(cè)試結(jié)果，結(jié)果表明，ICT通用型試紙條檢測(cè)的總體假陽(yáng)性率（6/33）小于 Mac ELISA法（9/33），然而，ICT通用型試紙條對(duì)上述4種傳染病均存在交叉反應(yīng)，而Mac ELISA檢測(cè)鉤體病時(shí)未出現(xiàn)交叉反應(yīng)現(xiàn)象，見(jiàn)表4。

表2 免疫層析法和捕獲ELISA法檢測(cè)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of ICS and Mac ELISA test

表3 免疫層析法分型檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Sero－typing test results of ICS

表4 兩種方法的交叉反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Cross－reactive antibody tested by two methods

3 討 論

登革病毒可分為1－4種血清型，任一種血清型病毒感染均可造成發(fā)熱、出疹、骨骼肌肉疼痛等典型的登革熱癥狀，嚴(yán)重者還可導(dǎo)致登革出血熱和登革休克綜合征；在感染早期，病毒在單核細(xì)胞內(nèi)迅速增殖并釋放到血液中，形成病毒血癥，在特異性免疫建立后，病毒才可得以逐步清除。因此病毒感染者在特異性抗體產(chǎn)生之前，將首先經(jīng)歷病毒血癥期，此時(shí)感染者血液中可以查到高滴度的病毒以及病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein 1，NS1）；處于病毒血癥期的感染者可通過(guò)伊蚊等媒介的叮咬將病毒傳給健康人，這是病毒在人群中傳播和擴(kuò)散的主要途徑。因此，在選擇和建立登革熱檢測(cè)方法和試劑時(shí)，應(yīng)考慮到上述特點(diǎn)。良好的檢測(cè)試劑除了具備相當(dāng)?shù)拿舾行院吞禺愋酝?，還應(yīng)具備：可以檢測(cè)所有4種型別的登革病毒感染；可以在感染的急性期檢出病毒核酸、抗原、抗體或等特異性靶標(biāo)；在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)盡量便捷、快速。

本研究建立的登革病毒IgM抗體膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法，除滿足上述要求外，還嘗試增加病毒血清學(xué)分型的功能，其原理是應(yīng)用登革病毒外膜蛋白DIII區(qū)的型特異性表位來(lái)檢測(cè)型特異性抗體，從而達(dá)到分型的目的。血清學(xué)分型的目的是為了使實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果更好地應(yīng)用于疾病控制，比如病毒傳染源的追蹤、回顧性調(diào)查等工作中。從此次小樣本檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看，通用型試紙條的檢測(cè)結(jié)果與Panbio公司的Mac ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果的一致性程度較高（Kappa＝0.799）。Panbio公司的Mac ELISA是目前市面上使用最為廣泛的試劑之一，具有較高的敏感性和特異性［7］。因此，本研究制備登革病毒IgM抗體膠體金免疫層析試紙條具有進(jìn)一步改進(jìn)和應(yīng)用的價(jià)值。從分型檢測(cè)的結(jié)果看，除了D1型試紙條可以清晰的判定對(duì)應(yīng)的型別，其它型別的試紙條均不能很好地區(qū)分病毒的型別，其中的原因可能是我們所使用的重組抗原材料中，存在除型特異性表位外還包含有型交叉反應(yīng)性表位［8］。有研究［7－9］表明，檢測(cè)登革病毒IgM 抗體時(shí)，可能與其它病原體抗體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，因此我們選取了部分流行性出血熱、恙蟲(chóng)、鉤體病、瘧疾等病例血清用于測(cè)試ICS試劑的交叉反應(yīng)情況，結(jié)果表明，與Mac ELISA比較，ICS法的交叉反應(yīng)較低，但I(xiàn)CS可能與更多的病原體抗體產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。盡管這個(gè)結(jié)論需要更大樣本量的測(cè)試，但至少提示，在登革病毒抗體的檢測(cè)中，交叉反應(yīng)問(wèn)題應(yīng)當(dāng)引起重視。

目前，國(guó)外針對(duì)登革病毒早期診斷的試劑已經(jīng)得到較為完善的發(fā)展，除了病毒抗體的檢測(cè)試劑外，還發(fā)展了包括NS1抗原檢測(cè)在內(nèi)的多種檢測(cè)試劑［10－11］，而國(guó)內(nèi)登革熱的檢測(cè)試劑研發(fā)尚處于起步階段，缺乏具有競(jìng)爭(zhēng)力的產(chǎn)品，特別是在快速檢測(cè)試劑方面，與國(guó)外尚有較大的差距，本研究目的是利用本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)的重組抗原，研制快速檢測(cè)試劑，用于替代進(jìn)口產(chǎn)品，服務(wù)于我國(guó)的登革熱防控工作。本研究所制備的通用型檢測(cè)試紙條具有一定的潛力，后期我們將對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)，并使用大樣本量的標(biāo)本評(píng)價(jià)其應(yīng)用效果。

［1］Nathan MB，Dayal－Drager R，Guzman M，et al.Epidemiology，disease－burden and transmission.In：Dengue：Guidelines for diagnosis，treatment，prevention and control［M］.A joint publication of the World Health Organization（WHO）and the Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases（TDR），new edition，2009：3－16.

［2］Yan YS，Hong RT，Shen XN，et al.Study on epidemiology and etiologic agent of dengue fever outbreak in Fuzhou in 2004［J］.Chin J Epidemiol，2006，5（27）：371－374.（in Chinese）嚴(yán)延生，洪榮濤，沈曉娜，等.福州市2004年登革熱流行病學(xué)和病原學(xué)特征研究［J］.中華流行病學(xué)雜志，2006，5（27）：371－374.

［3］Weng YW，Hong RT，Zhang SY，et al.Epidemiological investigation on the dengue fever outbreak in Putian，F(xiàn)ujian province in 2007［J］.Chin J Zoonoses，2009，25（4）：330－333.（in Chinese）翁育偉，洪榮濤，張山鷹，等.福建省莆田市2007年登革熱暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查分析［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25（4）：330－333.

［4］Lin F，F(xiàn)an WZ，Lin JF，et al.Epidemiological survey on a dengue fever outbreak in Yiwu，Zhejing province［J］.Dis Surveill，2010，25（9）：757－759.（in Chinese）凌鋒，范偉忠，林君芬，等.浙江省義烏市一起登革熱暴發(fā)疫情流行病學(xué)調(diào)查［J］.疾病監(jiān)測(cè)，2010，25（9）：757－759.

［5］Weng YW，Zhang ZS，Lin MQ，et al.Expression of recombinant envelope antigens of 4serotypes of dengue virus［J］.Chin J Zoonoses，2012，28（9）：894－897.（in Chinese）翁育偉，張志珊，林梅清，等，4種血清型登革病毒外膜蛋白重組抗原的表達(dá)［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28（9）：894－897.

［6］Lanciotti RS，Calisher CH，Gubler DJ，et al.Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase polymerase chain reaction［J］.J Clin Microbiol，1992，30（3）：545－551.

［7］Blacksell SD，Jarman RG，Gibbons RV，et al.Comparison of seven commercial antigen and antibody enzyme－linked immunosorbent assays for detection of acute dengue infection［J］.Clin Vaccine Immunol，2012，19（5）：804－810.DOI：10.1128/CVI.05717－11

［8］Midgley CM，F(xiàn)lanagan A，Tran HB，et al.Structural analysis of a dengue cross－reactive antibody complexed with envelope domain III reveals the molecular basis of cross－reactivity［J］.J Immunol，2012， 188 （10）： 4971－4979. DOI： 10.4049/jimmunol.1200227

［9］Blacksell SD，Jarman RG，Bailey MS，et al.Evaluation of six commercial point－of－care tests for diagnosis of acute dengue infections：the need for combining NS1antigen and IgM/IgG antibody detection to achieve acceptable levels of accuracy［J］.Clin Vaccine Immunol，2011，18（12）：2095－2101.DOI：10.1128/CVI.05285－11

［10］Bisordi I，Rocco IM，Suzuki A，et al.Evaluation of dengue NS1 antigen detection for diagnosis in public health laboratories，Sao Paulo State，2009［J］.Rev Inst Med Trop Sao Paulo，2011，53（6）：315－320.DOI：10.1590/S0036－46652011000600003

［11］de la Cruz Hernández SI，González Mateos S，F(xiàn)lores Aguilar H，et al.Evaluation of a novel commercial rapid test for dengue diagnosis based on specific IgA detection［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2012，72（2）：150－155.DOI：10.1016/j.diagmicrobio.2011.11.002