梁慶福，鄭金鳳，2，陳求揚(yáng)，林淑芳，魏淑貞，趙 永，林 建

2.福建省醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院教學(xué)基地，福州 350004

吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）是重要的抗結(jié)核一線藥物，由于它在酸性（pH 5.5）環(huán)境中能殺滅半休眠期結(jié)核分枝桿菌，而其他藥物所無法做到，因此可縮短結(jié)核病化療期，在現(xiàn)代結(jié)核病控制中起著不可或缺的作用。但是實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，因而各國(guó)常規(guī)抗結(jié)核藥物敏感試驗(yàn)中均將吡嗪酰胺項(xiàng)空缺［1］。為初步了解肺結(jié)核患者對(duì)吡嗪酰胺的耐藥情況，為臨床結(jié)核病防治提供參考，我們采用WHO推薦的BACTEC MGIT－960系統(tǒng)法［2］對(duì)218例涂陽(yáng)肺結(jié)核進(jìn)行吡嗪酰胺耐藥性檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來自2008－2011年間全省結(jié)核病耐藥性監(jiān)測(cè)納入的分離菌株，隨機(jī)選取218株，具有常規(guī)藥敏結(jié)果等相關(guān)資料信息，菌型鑒定均為結(jié)核分枝桿菌。218例病例中初治163例，復(fù)治55例；男性164例，女性54例；耐多藥（multi－drug－resistant，MDR）91例，非MDR127例。年齡16～81歲。

1.2 儀器和試劑 美國(guó)BD公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT－960全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)、鑒定、藥敏分析系統(tǒng)（BACTEC MGIT－960）及其配套試劑，包括MGIT培養(yǎng)管、MGIT OADC營(yíng)養(yǎng)添加劑、PANTA雜菌抑制劑、吡嗪酰胺試劑等。

1.3 培養(yǎng)方法和藥物敏感試驗(yàn) MGIT培養(yǎng)管在無菌條件下加入0.8mL MGITPANTA/OADC混合液備用。取保存的菌液接種于已準(zhǔn)備好的MGIT培養(yǎng)管中，將該管置入BACTEC MGIT－960中，儀器自動(dòng)檢測(cè)，判斷培養(yǎng)管內(nèi)分枝桿菌的生長(zhǎng)情況，若出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，儀器自動(dòng)提示。取出陽(yáng)性培養(yǎng)管后，進(jìn)行直接涂片抗酸染色，確認(rèn)是否為分枝桿菌。取0.5mL經(jīng)確認(rèn)為分枝桿菌的BACTEC MGIT－960陽(yáng)性培養(yǎng)物接種于含標(biāo)準(zhǔn)濃度藥物的PZA藥敏專用MGIT培養(yǎng)管中（含PZA添加劑），培養(yǎng)物1∶10稀釋接種于PZA藥敏專用MGIT培養(yǎng)管（含PZA添加劑）中作為生長(zhǎng)對(duì)照，然后置于BACTEC MGIT－960中，儀器根據(jù)分枝桿菌生長(zhǎng)情況對(duì)比自動(dòng)報(bào)告藥物敏感性結(jié)果。BACTEC MGIT－960系統(tǒng)測(cè)量嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠家的操作說明進(jìn)行。藥物濃度為：吡嗪酰胺（PZA，Z）100μg/mL。

1.4 質(zhì)量控制 每批試驗(yàn)用H37Rv做對(duì)照，同時(shí)對(duì)耐吡嗪酰胺菌株進(jìn)行再次復(fù)核以確保結(jié)果準(zhǔn)確性。H37Rv由中國(guó)CDC結(jié)核病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 有關(guān)定義［3］初治涂陽(yáng)肺結(jié)核：既往未用過或試用過抗結(jié)核藥物治療；應(yīng)用抗結(jié)核藥物治療（不論什么疾?。┎蛔?個(gè)月的涂陽(yáng)肺結(jié)核患者。復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核：使用抗結(jié)核藥物治療≥1個(gè)月的涂陽(yáng)肺結(jié)核患者。耐多藥（multi－drug－resistant，MDR）：指結(jié)核分枝桿菌至少對(duì)異煙肼、利福平2種及以上抗結(jié)核藥物耐藥。

1.7 生物安全 所有實(shí)驗(yàn)操作均在BSL－2及以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

2 結(jié) 果

218例涂陽(yáng)肺結(jié)核中耐吡嗪酰胺39例，占17.9%。其中164例男性患者耐吡嗪酰胺27例，占16.5%，54例復(fù)治患者耐吡嗪酰胺12例，占22.2%；163例初治患者耐吡嗪酰胺23例，占14.1%，55例復(fù)治患者耐吡嗪酰胺16例，占29.1%；91例MDR患者耐吡嗪酰胺36例，占39.6%，127例非MDR患者耐吡嗪酰胺3例，占2.4%。男女患者吡嗪酰胺耐藥率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而復(fù)治患者吡嗪酰胺耐藥率明顯高于初治患者（P＜0.05），MDR患者吡嗪酰胺耐藥率明顯高于非MDR患者（P＜0.01），見表1。

表1 218例涂陽(yáng)肺結(jié)核患者中的39例對(duì)吡嗪酰胺耐藥分析Tab.1 Analysis on PZA resistance in 39cases of 218smear positive pulmonary tuberculosis patients

3 討 論

自上世紀(jì)50年代以來，吡嗪酰胺就是用于結(jié)核病治療的一線藥物。最新研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺進(jìn)入患者體內(nèi)后，通常會(huì)轉(zhuǎn)化為具有活性的吡嗪酸。吡嗪酸可以綁定對(duì)結(jié)核桿菌至關(guān)重要的核糖體蛋白S1，阻止這種蛋白編碼結(jié)核桿菌的脫氧核糖核酸，進(jìn)而阻止結(jié)核桿菌產(chǎn)生維系其生存的其他蛋白［4］。正是通過這種方式，吡嗪酰胺可以將通常持續(xù)9至12個(gè)月的結(jié)核病療程縮短數(shù)個(gè)月，在現(xiàn)代結(jié)核病控制中起著重要的作用。由于PZA在結(jié)核病化療中的不可替代性，PZA藥敏試驗(yàn)顯得尤為重要，但由于PZA僅在低pH（約pH5.5）環(huán)境中有活性，而如此低的pH又限制了許多結(jié)核桿菌臨床株的生長(zhǎng)，因此難以在傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上建立可靠的PZA藥敏試驗(yàn)，因此各國(guó)常規(guī)抗結(jié)核藥敏無法開展此項(xiàng)檢測(cè)，這給臨床治療造成困難。

為了更好指導(dǎo)臨床對(duì)吡嗪酰胺的使用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了一定技術(shù)研究，如國(guó)內(nèi)敖軍平等研究的吡嗪酰胺耐藥性噬菌體檢測(cè)技術(shù)［5］，王冬敏等的顆粒顯色指示技術(shù)［6］等，均獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但未得到推廣使用。BACTEC MGIT－960系統(tǒng)法是具有美國(guó)FDA認(rèn)證的一線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)方法，被WHO推薦使用［2］，在發(fā)達(dá)國(guó)家通常作為標(biāo)準(zhǔn)方法，但其吡嗪酰胺耐藥性測(cè)定需要專用的培養(yǎng)基和配套試劑，費(fèi)用昂貴，限制了它的推廣應(yīng)用。

本研究采用WHO推薦的BACTEC MGIT－960系統(tǒng)法［2］進(jìn)行吡嗪酰胺藥物敏感性檢測(cè)，共檢測(cè)涂陽(yáng)肺結(jié)核患者218例，耐吡嗪酰胺39例，占17.9%，耐藥主要發(fā)現(xiàn)于MDR肺結(jié)核中，MDR肺結(jié)核吡嗪酰胺耐藥率達(dá)39.6%（36/91），接近孫冰梅等［7］報(bào)道的BACTEC 460法檢測(cè)MDR肺結(jié)核吡嗪酰胺耐藥率54.7%，且明顯高于非 MDR患者的2.4%（3/127）（P＜0.01），提示MDR肺結(jié)核更易發(fā)生吡嗪酰胺耐藥。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)治患者的吡嗪酰胺耐藥率（29.1%）也明顯高于初治患者（14.1%）（P＜0.05），這可能與復(fù)治患者中 MDR患者比例高（78.2%，43/55）有關(guān)。由于吡嗪酰胺是重要的抗結(jié)核一線藥物，是目前復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核和MDR肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)治療方案中的主要藥物［3，8］，鑒于本研究發(fā)現(xiàn)在復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核，尤其是MDR肺結(jié)核中對(duì)本藥的耐藥率較高，筆者認(rèn)為臨床應(yīng)重視對(duì)MDR肺結(jié)核患者吡嗪酰胺藥物敏感性的監(jiān)測(cè)，以選用合適的治療方案，確保MDR肺結(jié)核得到更合理有效的治療。同時(shí)建議有條件的地方應(yīng)把吡嗪酰胺藥敏納入復(fù)治涂陽(yáng)肺結(jié)核的常規(guī)檢測(cè)，甚至可直接作為臨床常規(guī)抗結(jié)核藥敏檢測(cè)項(xiàng)目，以更好指導(dǎo)臨床用藥。

本研究結(jié)果顯示肺結(jié)核吡嗪酰胺耐藥率較高，這與本檢測(cè)對(duì)象中 MDR肺結(jié)核比例高（41.7%，91/218）有關(guān)，其MDR肺結(jié)核的高耐吡嗪酰胺率提示將給現(xiàn)行的MDR肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)治療方案提出挑戰(zhàn)，值得深入探討。

（感謝福建省立醫(yī)院胡辛蘭老師對(duì)本課題工作的大力幫助）

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