王 濤，王 亮，杜冬冬，莊燕飛，常維山

2.秦皇島出入境檢驗檢疫局，秦皇島 066004

沙門氏菌是危害人類與畜禽等動物的一類病原菌，其血清型超過2 000個，我國已發(fā)現(xiàn)216個［1－2］。鑒于其危害性能夠準(zhǔn)確的鑒定沙門氏菌的基因型，對于沙門氏菌的防控與流行病學(xué)調(diào)查有重要意義。目前對于沙門氏菌的分類方法有多種比如分離培養(yǎng)、形態(tài)特征、生化反應(yīng)和免疫學(xué)、16srRNA基因測序 方 法［3］，ERIC－PCR 方 法、隨 機 擴 增 多 態(tài) 性DNA分型技術(shù)（RAPD）、基因外重復(fù)序列－PCR（rep－PCR）等。但是分離培養(yǎng)、形態(tài)特征、生化反應(yīng)和免疫學(xué)等方法均存在耗時長、特異性差、敏感度低等問題，難以滿足現(xiàn)代細菌學(xué)研究的發(fā)展要求。16s rRNA 基因測序方法［3］，ERIC－PCR方法、隨機擴增多態(tài)性DNA分型技術(shù)（RAPD）、基因外重復(fù)序列－PCR（rep－PCR）等方法存在準(zhǔn)確率低、不能夠?qū)崿F(xiàn)全球互享等缺點而多位點序列分型技術(shù)解決了上述難題。多位點序列分型 （multilocus sequence typing，MLST）是一種通過直接測定多個管家基因的核苷酸序列來發(fā)現(xiàn)細菌變異的分型方法。它由Maiden等［4］于1998年首次運用于腦膜炎奈瑟菌的分型，后來由于其結(jié)果精確并且易于傳遞而廣泛應(yīng)用于其他致病菌、真菌以及一些非致病菌。MLST有兩種分析方法，一種是以等位基因編號和ST編號為基本分析單位，還有一種就是直接分析核苷酸序列。選擇哪種方法取決于所要分析的細菌群體的構(gòu)成［5］在分析 MLST數(shù)據(jù)之前首先要確定所研究細菌群體的克隆程度，然后再根據(jù)需要選擇相應(yīng)的分析方法。目前該方法已廣泛應(yīng)用于霍亂弧菌、空腸彎曲菌、葡萄球菌、單增李斯特菌等細菌的分型研究［6－7］。本次試驗主要運用分離培養(yǎng)、形態(tài)特征、生化反應(yīng)和免疫學(xué)、16srRNA基因測序方法［3］、多位點序列分型等鑒定方法對于臨床上分離的一株沙門氏菌進行鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 由本實驗室從患病蛋雞肝臟中分離保存的一株雞沙門氏菌

1.1.2 主要試劑 麥康凱瓊脂、DHL瓊脂、SS瓊脂、三糖鐵瓊脂（均購自杭州天和微生物試劑有限公司）；沙門氏菌診斷血清（寧波天潤生物藥業(yè)有限公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物技術(shù)公司）；PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒（上海生工生物工程公司）；ExTaqDNA 聚合酶、dNTP、MgCl2、Trans2KPlusⅡDNA Marker購自北京全式金生物科技有限公司；TGL－16B型微量離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；JunYi JY200C型電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司，76－0312－02）。

1.2 沙門氏菌分離增殖 取實驗室分離保存的沙門氏菌先在非選擇性蛋白胨水中進行非選擇性增菌，再用亞酸鹽胱氨酸增菌液進行選擇性增菌培養(yǎng)。通過選擇性增殖能夠抑制沙門氏菌以外的其它細菌的生長。

1.3 沙門氏菌培養(yǎng)特性及形態(tài)學(xué)觀察 分離菌接種于營養(yǎng)肉湯、麥康凱瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂培養(yǎng)基、和血液瓊脂，置于37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察細菌生長情況及菌落特征。將細菌純培養(yǎng)物接種三糖鐵瓊脂，37℃培養(yǎng)24h。挑取培養(yǎng)基上可疑菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢。沙門氏菌在不同培養(yǎng)基上面的生長狀況不同，通過鑒別培養(yǎng)可以初步對沙門氏菌進行鑒定。

1.4 生化反應(yīng)及血清學(xué)鑒定 參考以往的文獻做了如下生化試驗［8－9］將分離菌株接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇 、衛(wèi)矛醇、尿素、硫化氫，并進行枸櫞酸鹽利用、吲哚試驗和V－P試驗等生化試驗，置于37℃溫箱培養(yǎng)，每日觀察。

按照沙門氏菌診斷血清（60種）說明書（寧波天潤生物藥業(yè)有限公司），將臨床所分離的沙門氏菌的培養(yǎng)物與沙門氏菌屬診斷血清進行凝集試驗，10 min內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。

1.5 16srRNA基因序列分析法菌株鑒定 挑取單菌落接種在LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h。用細菌基因組DNA提取試劑盒嚴(yán)格按照說明書進行DNA組提取，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ谜蛞?27F5－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3和反向 引 物 1492R5－TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3擴增細菌16sRNA基因。

PCR擴增體系：10×buffer 2.5μL；Mg2＋2 μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；模板 DNA 0.5μL；dNTP 0.5μL；雙蒸水18.3μL；ExTaq DNA聚合酶0.2μL。

擴增條件：94℃ 預(yù)變性10min（94℃變性50 s，55℃退火50s72℃延伸1min 50s，30個循環(huán)）72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收，回收產(chǎn)物由上海生物工程有限公司進行測序。

1.6 管家基因位點的擴增 7個管家基因分別為thrA、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、aroC根 據(jù)PubMLST（http：//pubmlst.org）及ncbi上公布的基因片段設(shè)計引物如表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 7個管家基因引物序列Tab.1 Sequences of all primers used in the 7housekeeping genes

PCR擴增體系：10×buffer 2.5μL；Mg2＋2 μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；模板 DNA 0.5μL；dNTP0.5μL；雙蒸水18.3μL；ExTaq DNA聚合酶0.2μL。

擴增條件：94℃ 預(yù)變性10min（94℃變性50 s，54℃退火50s72℃延伸1min 30s，30個循環(huán)）72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收，回收產(chǎn)物由上海生物工程有限公司進行測序

1.7 測序結(jié)果比對 序列測定結(jié)果使用DNA Star軟件根據(jù)Pub MLST［10］規(guī)定進行修正；7個管家基因測序結(jié)果與Pub MLST數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得各管家基因位點的等位基因數(shù)值，并形成相應(yīng)的等位基因譜，判斷其序列型。

2 結(jié) 果

2.1 分離株培養(yǎng)特性 分離菌在營養(yǎng)瓊脂上呈圓形、微隆起、光滑濕潤、半透明、邊緣整齊、針尖大小、露珠狀的小菌落。在麥康凱瓊脂上長出無色透明、圓形的小菌落。在鮮血瓊脂上不溶血。在SS瓊脂上成無色透明小菌落。肉湯培養(yǎng)基呈均勻混濁，管底有少量沉淀物。三糖鐵培養(yǎng)基斜面為紅色，底層為黑色。革蘭氏染色該細菌呈紅色小桿菌。

2.2 分離菌生化特性 如表2所示該細菌能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇和產(chǎn)生硫化氫；不能發(fā)酵乳糖、蔗糖；V－P試驗、吲哚試驗、尿素試驗、枸櫞酸銨鹽利用試驗均為陰性。根據(jù)《伯杰氏手冊》［10］關(guān)于腸炎沙門氏菌生化反應(yīng)特征的標(biāo)準(zhǔn)，該株細菌符合腸炎沙門氏菌的生化特征。

表2 分離菌生化試驗結(jié)果Tab.2 Results of bacteria biochemical test

2.3 分離菌血清學(xué)試驗結(jié)果 分離菌抗原式為O3，19（＋）；O9（＋）；Hg，p（＋）；Hg（＋）；Hm（＋），根據(jù)《伯杰氏手冊》［10］關(guān)于腸炎沙門氏菌血清學(xué)抗原式的規(guī)定，該株細菌符合腸炎沙門氏菌抗原式。

2.4 16sRNA擴增測序結(jié)果 經(jīng)過16sRNA擴增測序，凝膠電泳擴得大小為1 467bp的目的片段如圖1所示。其序列在ncbi比對結(jié)果與腸炎沙門氏菌P125109（NC＿011294.1）同源性為100%。

2.5 管家基因擴增結(jié)果 如圖2所示7個管家PCR皆擴增到大小一致的目的片段，sucA目的片段大小為643bp；thrA目的片段大小為628bp；dnaN目的片段大小為615bp；hemD目的片段大小為587bp；pure目的片段大小為480bp；hisD目的片段大小為755bp；aroC目的片段大小為833bp。

圖1 16sRNA擴增結(jié)果Fig.1 PCR product of 16sRNA

圖2 管家基因PCR結(jié)果Fig.2 PCR product of housekeeping gene

2.6 腸炎沙門氏菌 MLST分型結(jié)果 對于上述7個管家基因膠回收目的片段交由上海生工測序，測序結(jié)果經(jīng)整理后上傳國際MLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫中沙門氏菌7個管家基因比對得出如表3結(jié)果，該株腸炎沙門氏菌基因型為ST11。

3 討 論

本次試驗對于臨床上分離細菌運用培養(yǎng)特性、細菌形態(tài)、生化試驗、血清學(xué)鑒定、16sRNA鑒定、多位點序列分型等試驗方法進行了鑒定。培養(yǎng)特性、細菌形態(tài)、生化試驗鑒定結(jié)果顯示該株細菌符合《伯杰氏手冊》［10］關(guān)于腸炎沙門氏菌的生物學(xué)特性。血清學(xué)試驗結(jié)果顯示該株細菌抗原式為O3，19（＋）；O9（＋）；Hg，p（＋）；Hg（＋）；Hm（＋），符合《伯杰氏手冊》［10］上關(guān)于腸炎沙門氏菌鑒定的抗原式。16sRNA測序鑒定結(jié)果與GenBank上比對，該株腸炎沙門氏菌與腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)125109（NC＿011294.1）同源性100%。該株腸炎沙門氏菌多位點序列分型結(jié)果顯示，該株腸炎沙門氏菌基因型號為ST11。最終確定該株細菌為腸炎沙門氏菌，抗原式為O3，19（＋）；O9（＋）；Hg，p（＋）；Hg（＋）；Hm（＋），ST11。據(jù)報道雞腸炎沙門氏菌P125109最早分離自蛋雞。本次是創(chuàng)新點在于運用多種試驗方法對臨床上分離的1株沙門氏菌進行分類，并且運用了目前細菌分類學(xué)中比較準(zhǔn)確的方法多位點序列分型法。

表3 MLST結(jié)果Tab.3 Results of MLST

本次試驗運用了多位點序列分型方法對臨床分離株腸炎沙門氏菌進行了分型，分型結(jié)果與國際MLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中有關(guān)腸炎沙門氏菌流行情況進行了比對。比對發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌ST11基因型在中國、歐洲、美國等地都有發(fā)現(xiàn)，其存在于人類體內(nèi)、雞體內(nèi)、食物中。英國的一項調(diào)查表明，腸炎沙門氏菌 和鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）感染占到人類沙門氏菌感染病例的75%以上［11］；日、美等發(fā)達國家發(fā)生的食物中毒事件中40%～80%是由禽沙門氏菌引起的，其中主要病原菌為腸炎沙門氏菌。

多位點序列分型可以準(zhǔn)確定位不同細菌的系譜，并且可以通過管家基因比較確定細菌間的遺傳差異，準(zhǔn)確率高［12－16］。多位點序列分型是在 DNA分子水平的細菌分型方法，多選擇6～7個管家基因進行序列分析。對于同一基因必須選擇同一引物進行擴增所以必須選擇高度保守的管家基因。MLST是一種高分辨力的分型方法，適合長期大范圍、全球性的流行病學(xué)調(diào)查研究［17］。

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