程君生，吳梅花，趙麗霞，彭小兵，丁家波，王 楠，夏業(yè)才，毛開榮

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010030)

布魯氏菌病(簡稱布病)是一種世界范圍流行的人畜共患病，嚴(yán)重威脅人類和多種動物的生命健康，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。布病導(dǎo)致動物流產(chǎn)、不孕和奶產(chǎn)量減少等，同時也引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題［1-2］。絕大多數(shù)布魯氏菌菌株都可以感染人，并引起嚴(yán)重的疾病，需要長時間的抗生素治療，而且往往會留下嚴(yán)重的后遺癥［3］。截至2007年的十五年中，布病疫情呈持續(xù)增長態(tài)勢，愈演愈烈［4］。根據(jù)衛(wèi)生部網(wǎng)站上的疫情公告，從2009年至2011年，我國人間布病新發(fā)病人數(shù)均超過3萬人，處于歷史最高水平。

疫苗免疫是防控家畜布病的主要措施。我國現(xiàn)有獸用布病疫苗制苗菌株有3種，分別為羊種布魯氏菌M5或M5-90弱毒株、豬種布魯氏菌S2弱毒株和牛種布魯氏菌A19弱毒株［4］。20世紀(jì)70-90年代，以上3種疫苗對我國布病疫情的控制起了至關(guān)重要的作用。至今，這3種疫苗仍在我國被廣泛使用。布魯氏菌病屬不同種型的菌株在外界各種因素的影響下可以發(fā)生變異，特別是在實驗室里，由于長期菌株保存的不當(dāng)而發(fā)生變異的現(xiàn)象更為常見［5］。作為一種重要的人畜共患細(xì)菌病活疫苗，菌株的遺傳穩(wěn)定性是確保疫苗質(zhì)量的前提。毒力測定是監(jiān)測菌株是否變異的方法之一，也是確保疫苗安全的重要保證。國際上通常有3種方法反映布魯氏菌的毒力:對豚鼠的最小感染量、感染豚鼠的脾臟含菌量以及感染小鼠體內(nèi)的存活時間，其中對豚鼠的最小感染量通常用于對強(qiáng)毒株布魯氏菌毒力的測定。為了系統(tǒng)比較以上3種疫苗株的毒力，本研究用小鼠體內(nèi)存活時間和豚鼠脾含菌量2種方法，對上述3種布病疫苗株的毒力進(jìn)行了測定和分析。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 牛種布病疫苗(A19株)、豬種布病疫苗(S2株)均來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心;羊種布病疫苗(M5株)來自國內(nèi)某獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)。胰眎瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨水、PBS、生理鹽水等由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障處參照《中國獸用生物制品規(guī)程》二○○○年版制備。PCR反應(yīng)試劑盒(Lot:DR001B)、DNA Marker DL2000(Lot:D501A)均購自TAKARA公司。

1.2 實驗動物 雌性 Balb/c小鼠(SPF級)和Hartley豚鼠(SPF級)均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 菌液制備與濃度測定 分別將各凍干布病疫苗菌株用生理鹽水溶解后，劃線接種于胰眎瓊脂培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)48 h，用生理鹽水沖洗培養(yǎng)物制成懸液，立即置于冰水中。充分混勻后，取0.1 mL菌液在96孔酶標(biāo)板上用生理鹽水作2倍梯度稀釋至第11孔，用分光光度計測定OD600值。將原始菌液稀釋至OD600=0.1后，再用生理鹽水作連續(xù)10倍梯度稀釋至10-6，取該稀釋管接種胰眎瓊脂平皿，每皿接種0.1 mL，每個樣品接種3塊平皿。將計數(shù)的平皿置于37℃溫箱培養(yǎng)72 h，根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果計算菌液濃度。

1.4 疫苗株在小鼠體內(nèi)的存留時間測定 將16～18 g的健康雌性BALB/c小鼠120只，隨機(jī)分為3組，分別腹股溝皮下接種疫苗株A19、M5、S2，每組40只，注射劑量均為1×105CFU/只。接種后每隔2周撲殺5只小鼠，取出脾臟，加入1 mL無菌生理鹽水后，用小型組織勻漿機(jī)(IKA)將其搗碎。分別取勻漿按原液0.1 mL涂布胰眎瓊脂平板，置于37℃溫箱培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)菌生長情況。參照已發(fā)表的文獻(xiàn)［6-7］，設(shè)計表1所示的各引物，用于對分離菌進(jìn)行特異性鑒定。

表1 用于區(qū)分布魯氏菌種屬的PCR引物序列

1.5 疫苗株對豚鼠的毒力 參照《中華人民共和國獸醫(yī)生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版對布病疫苗菌種毒力的測定方法［8］，取350～400 g的健康雌性豚鼠15只，隨機(jī)分為3組，每組5只，分別腹股溝皮下接種疫苗株 A19、M5、S2，注射劑量均為1×109CFU/只。接種后15 d撲殺各組豚鼠，無菌采集脾臟混合稱重。根據(jù)稱重結(jié)果，分別加入等量滅菌生理鹽水，用小型組織搗碎機(jī)將各組樣品搗碎，制成懸液。吸取0.1 mL，用生理鹽水10倍梯度連續(xù)稀釋，分別取1∶10和1∶100稀釋液涂布胰眎瓊脂平板，置于37℃溫箱培養(yǎng)72 h，選擇合適的稀釋度計算每克脾臟細(xì)菌含量。

2 結(jié)果

2.1 菌液制備與濃度測定 各疫苗株在胰眎瓊脂培養(yǎng)基上均能良好生長。按1.3中描述的方法，計算OD600=0.1時三種布魯氏菌的濃度。結(jié)果在此濁度下，A19、M5 和 S2的濃度均約為2.5 ×109CFU/mL。

2.2 各疫苗株在小鼠體內(nèi)的存留時間 疫苗免疫后實驗小鼠脾臟內(nèi)分離細(xì)菌生長情況見表2。

表2 各布魯氏菌疫苗株在小鼠體內(nèi)不同時間分離細(xì)菌情況

從平板上隨機(jī)挑取3個菌落，用AMOS-PCR方法對分離菌進(jìn)行特異性鑒定。PCR電泳結(jié)果顯示，從小鼠脾臟中分離的各細(xì)菌均與免疫株一致，即牛種布魯氏菌S19株出現(xiàn)大小為178 bp和494 bp的特異性條帶，羊種布魯氏菌M5株出現(xiàn)大小為178 bp和733 bp的特異性條帶，豬種布魯氏菌S2株出現(xiàn)大小為178 bp和285 bp的特異性條帶(圖1)。

2.3 各疫苗株對豚鼠的毒力 疫苗免疫后15 d，取豚鼠脾臟計數(shù)克脾臟含菌量，結(jié)果見表3。A19疫苗株感染的豚鼠克脾臟含菌量最高為17萬，S2最高為1.5萬，均不超過20萬，符合我國《獸用生物制品規(guī)程》中對布病疫苗種毒的毒力規(guī)定［7］。M5疫苗株感染的豚鼠克脾臟含菌量最低為67萬，高于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 小鼠脾臟分離菌的PCR種屬鑒定結(jié)果

表3 不同疫苗株免疫的豚鼠脾臟含菌量測定結(jié)果

3 討論

布魯氏菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，其感染動物后，會激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，其中細(xì)胞免疫對抗感染起著主要作用。由于活疫苗可以激起有效的細(xì)胞免疫，產(chǎn)生良好的保護(hù)效果，因此迄今為止，絕大多數(shù)成功應(yīng)用的疫苗都是弱毒疫苗。我國目前使用的A19、M5和S2疫苗株，均為光滑型弱毒疫苗。不同布病疫苗株其毒力也各不相同，其毒力的大小決定了該疫苗的安全性。

豚鼠對布魯氏菌具有高度的敏感性，是研究布病的良好試驗?zāi)Ｐ?，常用于分離布魯氏菌，測定布魯氏菌毒力，檢定布病疫苗的效力等［9］?！东F用生物制品規(guī)程》中對布病疫苗種毒的毒力規(guī)定，以10億劑量的活菌免疫豚鼠14～15 d后，每組(5只/組)豚鼠的克脾臟含菌量應(yīng)不超過20萬個［8］。本研究結(jié)果顯示，M5毒力最強(qiáng)，A19次之，S2最弱。

小鼠體內(nèi)持續(xù)期也是常用作評價布病疫苗株安全性的重要指標(biāo)之一，其對布魯氏菌的敏感性僅次于豚鼠。一般來說，強(qiáng)毒布氏菌具有在體內(nèi)持續(xù)感染的特征，體內(nèi)持續(xù)感染的時間越長，對機(jī)體的損傷會越大。對于弱毒菌株，體內(nèi)感染時間的增加，有提高免疫保護(hù)力的有利作用，但也增加了毒力變強(qiáng)的可能性。本研究中A19和S2疫苗株在小鼠體內(nèi)的持續(xù)時間分別為14周和6周，而M5卻超過了16周，同樣證明了M5疫苗的毒力超過了其他2個疫苗株。

相對于其他種的光滑型布魯氏菌疫苗株，羊種布魯氏菌疫苗株的穩(wěn)定性相對較差。有報道稱，國際上較早使用的羊種布病疫苗株Rev.1在適當(dāng)?shù)臈l件下毒力可以完全恢復(fù)［10-11］。因此，對這類疫苗菌株的繁殖制備需要嚴(yán)格控制。我們的試驗研究顯示，M5疫苗在小鼠體內(nèi)存活時間較長，在豚鼠體內(nèi)含菌量較高，是否與疫苗菌株在制備繁殖中控制不當(dāng)或在一定條件下有毒力返強(qiáng)有關(guān)，需進(jìn)一步證實。

為保證疫苗使用的安全性和有效性，有必要對布魯氏菌病疫苗菌株的遺傳穩(wěn)定性，特別是對毒力和免疫原性的穩(wěn)定等進(jìn)行進(jìn)一步評價，更深入地了解各個疫苗菌株的特性，有效控制其毒力穩(wěn)定性和免疫原性，為家畜布魯氏菌病免疫預(yù)防提供更可靠的保障。

［1］Paranavitana C，Zelazow S E，Izad-Joo M，et al.Interferongamma associated cytokines and chemokines produced by spleen cells from Brucella-immune mice［J］.Cytokine，2005，30:86-92.

［2］Hamdy M E，El-Gibaly S M，Montasser A M.Comparison between immune responses and resistance induced in BALB/c mice vaccinated with RB51 and Rev1 vaccines and challenged with Brucella melitensis bv.3［J］.Vet Microbiol，2002，88:85-94.

［3］Moriyon I，Grillo M J，Monreal D，et al.Rough vaccines in animal brucellosis:Structural and genetic basis and present status［J］.Vet Res，2004，35:1-38.

［4］崔步云.中國布魯氏菌病疫情監(jiān)測與控制［J］.疫病監(jiān)測，2007，22(10):649-651.

［5］ 劉秉陽.布魯氏菌病學(xué)［M］.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1989:36.

［6］丁家波，張存帥，彭小兵，等.布魯氏菌種屬鑒定多重PCR方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2009，29(5):594-597.

［7］彭小兵，程君生，夏業(yè)才，等.多重PCR方法鑒別牛、羊、豬種布魯氏菌株［J］.中國獸藥雜志，2010，44(2):12-14.

［8］中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程［M］.二○○○年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社.154-160.

［9］Davis D S，Elzer P H.Brucella vaccines in wildlife［J］.Vet Microbiol，2002，90(11):533-544.

［10］Bosseray N.Brucella melitensis Rev.1 living attenuated vaccine:Stability of markers，residual virulence and immunogenicity in mice［J］.Biologicals，1991，19:355-363.

［11］ Grilló M J，Bosseray N，Blasco J M，et al.In vitro markers and biological activity in mice of seed lot strains and ommercial Brucella melitensis Rev.1 and Brucella abortus B19 vaccines［J］.Biologicals，2000，28:119-127.