李慧素，吳寧鵬，班付國(guó)，彭 麗，周紅霞

(河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008)

氯苯胍(Robenidine)是一種新型高效合成抗球蟲藥，分子式為C15H13Cl2N5，相對(duì)分子質(zhì)量為334，化學(xué)名:1，3-雙-對(duì)氯苯叉氨基胍，其結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 氯苯胍化學(xué)結(jié)構(gòu)式

氯苯胍自1977年在我國(guó)上市后，因其療效顯著、毒性小，具有提高增重和飼料利用率的作用，在獸醫(yī)臨床上得到廣泛應(yīng)用。然而，過(guò)量使用或長(zhǎng)期使用不當(dāng)會(huì)在禽肉產(chǎn)品中產(chǎn)生殘留。有報(bào)道稱，在肉雞日糧中添加量為66 g/t時(shí)，屠宰的新鮮肉質(zhì)中就會(huì)產(chǎn)生由于氯苯胍殘留而產(chǎn)生的異味，以33g/t的含量飼喂蛋雞時(shí)，在雞蛋中就會(huì)察出異味。因此應(yīng)在肉禽上市前5～7 d停藥，產(chǎn)蛋禽禁用。但是，一些養(yǎng)殖者為追求利潤(rùn)，直到屠宰前才停止添加藥物，這樣肯定會(huì)使藥物殘留超標(biāo)，危害人民的身體健康。為了保障動(dòng)物性食品的質(zhì)量安全，保證民眾的健康和產(chǎn)品出口，有必要對(duì)動(dòng)物性食品中氯苯胍的殘留進(jìn)行監(jiān)控。

目前，中國(guó)、歐盟及美國(guó)等多個(gè)國(guó)家都制訂了氯苯胍在動(dòng)物源食品中的最高殘留限量，我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定雞皮與脂肪中的最大殘留量為200 μg/kg，其他可食組織為 100 μg/kg［1］。目前，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的有 HPLC［2］、HPLC-MS/MS 檢測(cè)方法［3，6］，國(guó)內(nèi)報(bào)道主要是高效液相色譜法。本方法參考已有的文獻(xiàn)資料，通過(guò)多次試驗(yàn)，建立了能很好滿足獸藥殘留檢測(cè)方法要求的雞組織中氯苯胍殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司);XP205分析天平(瑞士 Mettler Toledo公司)，SIGMA 3-30K離心機(jī)(德國(guó) Sigma公司);Spe-Al-N固相柱(500 mg/3 mL);HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純;氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品含量為 93.0%，購(gòu)于德國(guó) Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司;D8-氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品含量為99.3%，購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。

1.4 內(nèi)標(biāo)溶液的配制(1 mg/mL) 精密稱取D8-氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，于10 mL容量瓶中，用二甲亞砜溶解后，用甲醇稀釋至刻度，制成1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取1 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，制成 100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 色譜條件色譜柱:Acquity UPLC?BEH C18(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);柱溫30℃;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量 5 μL;流動(dòng)相:A 相為乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液;梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜參考條件 電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè);源溫度 120℃;脫溶劑溫度350℃;電離電壓3.0 kV;測(cè)試藥物定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 氯苯胍及內(nèi)標(biāo)定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量

1.5.3 樣品前處理 稱取均質(zhì)后(2±0.02)g試料，置于50 mL離心管內(nèi)，加入1 μg/mL氯苯胍-D8內(nèi)標(biāo)溶液 100 μL，再加入 0.1% 甲酸乙腈5 mL，渦旋混合后中速振蕩10 min，7500 r/min離心10 min，取上清液于另一10 mL離心管內(nèi)，加水1 mL，混勻。中性氧化鋁小柱用乙腈2 mL活化，取全部提取液過(guò)柱，收集全部流出液于10 mL玻璃試管中，再用85%乙腈2 mL洗脫，合并流出液，于40℃下氮?dú)獯抵馏w積小于2 mL，再加入水8 mL，備用。HLB固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，取全部備用液過(guò)柱，用水3 mL淋洗，抽干30 s，正己烷3 mL淋洗，抽干10 min，甲醇5 mL洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?5%乙腈1.0 mL溶解，渦旋，過(guò)濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 量取氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)工作溶液適量，用85%乙腈稀釋，制得濃度為10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(內(nèi)標(biāo)均為100 ng/mL)，由低濃度到高濃度供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.5 準(zhǔn)確度與精密度 取空白組織，在肌肉、肝臟、腎臟組織中添加50、100、200 μg/kg 三個(gè)不同濃度，在脂肪、皮中添加100、200、400 μg/kg 三個(gè)不同濃度，分別進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個(gè)樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，計(jì)算回收率及批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.6 檢測(cè)限與定量限 添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于2.0 g空白樣品中，經(jīng)提取、凈化后測(cè)定，依據(jù)信噪比S/N≥3為檢測(cè)限，依據(jù)信噪比S/N≥10為定量限。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照上述方法制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的色譜條件下，氯苯胍回歸方程為Y=8.9885X+146.89，相關(guān)系數(shù) r=0.9985。結(jié)果表明:氯苯胍在120～500 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r＞0.99。

表3 空白雞組織中氯苯胍添加回收率試驗(yàn)(n=5)

2.2 準(zhǔn)確度與精密度 按照上述方法，在空白組織中添加三個(gè)不同濃度的氯苯胍進(jìn)行回收率試驗(yàn)。其結(jié)果見(jiàn)表3。可以看出氯苯胍在肝臟、肌肉、腎臟、脂肪和皮中平均回收率分別為 82.8% ～103.9%，85.0% ～ 107.6%、76.7% ～ 88.3%、80.9% ～91.6% 和 80.9% ～ 108.2%;批內(nèi)變異系數(shù)均在 1.0% ～20.0%之間，批間變異系數(shù)在2.5% ～12.8%之間。氯苯胍的標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試樣、空白添加試樣特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖2-圖4。

2.3 檢測(cè)限與定量限 氯苯胍在肌肉、肝臟、腎臟、脂 肪和皮中的檢測(cè)限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg。

3 討論

3.1 提取條件 已報(bào)道的氯苯胍提取用溶劑有乙腈［3-4］、乙酸乙酯［5］、甲醇［2］等，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，乙腈的提取效果要優(yōu)于甲醇和乙酸乙酯。根據(jù)氯苯胍的結(jié)構(gòu)特征，考察酸化乙腈和堿化乙腈兩種提取方法，發(fā)現(xiàn)用0.1%甲酸乙腈能獲得更高更穩(wěn)定的提取效果。

3.2 凈化條件 文獻(xiàn)中報(bào)道的用于凈化的固相萃取柱有硅膠柱、陽(yáng)離子交換柱、C18柱等。本方法參考文獻(xiàn)的凈化方法，選擇 Wters Oasis HLB(3 mL，60 mg)、Waters Sep-Pak Vac C18(3 mL，60 mg)、VARIAN BOND ELUT-C18(3 mL，100 mg)三種固相萃取柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種固相萃取柱對(duì)氯苯胍的回收率差別不大，但C18柱批內(nèi)的變異系數(shù)較大，因此選擇HLB柱進(jìn)行富集和凈化。

3.3 除脂肪方法 常用去除脂肪的方法包括液液萃取法、有機(jī)溶劑柱淋洗法［4-5］和固相萃取柱凈化。通過(guò)考察發(fā)現(xiàn)，在脂肪和皮組織中需要采用中性氧化鋁［2-3］固相萃取柱和正己烷淋洗HLB固相萃取柱兩步去除油脂，才能達(dá)到較好的凈化效果和較高的回收率。

3.4 離子對(duì)的選擇 根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證該類物質(zhì)至少需要4個(gè)識(shí)別點(diǎn)(IP)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［3，6］，本試驗(yàn)分別選擇了母離子以及對(duì)應(yīng)的兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性定量依據(jù)。分別采用ESI+和ESI-離子模式進(jìn)行調(diào)諧，但以正離子模式響應(yīng)值最高。

4 結(jié)論

本方法建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞組織中氯苯胍殘留，采用內(nèi)標(biāo)法，對(duì)五種基質(zhì)樣品提取、凈化后測(cè)定，得到了較高的檢測(cè)的靈敏度和回收率。通過(guò)方法學(xué)考察，本方法完全適合雞組織氯苯胍殘留的定性和定量檢測(cè)。

［1］農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告.動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［2］Kot-Wasik A，Wasik A.Determination of robenidine in animal feeds by liquid chromatography coupled with diode-array detection and mass spectrometry after accelerated solvent extraction［J］.Analytica Chimica Acta，2005，543:46-51.

［3］Malgorzata O，Teresa S J，Piotr J.Multi-residue confirmatory method for the determination of twelve coccidiostats in chicken liver using liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Chromatography A，2009，1216:8141-8148.

［4］劉勇軍，吳銀良，姜艷彬.高效液相色譜法測(cè)定雞組織與雞蛋中氯苯胍的殘留量［J］.色譜，2010，28(9):905-907.

［5］周昭明，曾 勇，金秀娥.雞、兔組織中氯苯胍殘留的檢測(cè)方法研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2005，39(3):19-22.

［6］Delahaut P，Pierret G，Ralet N，et al.Multi-residue method for detecting coccidiostats at carry-over level in feed by HPLCMS/MS［J］.Food Additives and Contaminants，2010，27(6):801-809.