華利忠，劉茂軍，馮志新，張小飛，邵國(guó)青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014;2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102)

豬支原體肺炎(Mycoplasma Pneumonia of Swine，MPS)防控和凈化是當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)面臨的難題之一。臨床上主要依靠藥物控制、疫苗免疫以及改善飼養(yǎng)管理方式如全進(jìn)全出、早期隔離斷奶，多點(diǎn)式生產(chǎn)模式等進(jìn)行豬氣喘病的防控和凈化［1-3］。無(wú)論采用哪些方法，都必須建立相應(yīng)的評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)衡量這些控制或凈化措施的效果，以便于豬場(chǎng)今后更好的控制豬支原體肺炎。目前，臨床上對(duì)豬支原體肺炎控制與凈化的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有臨床癥狀，肺部肉變?cè)u(píng)分，生產(chǎn)指標(biāo)(料肉比、出欄重、日增重等)，經(jīng)濟(jì)效益等，如果涉及疫苗免疫，各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)也是評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。

1 常規(guī)評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.1 臨床癥狀及發(fā)病率 豬支原體肺炎防控和凈化效果的評(píng)價(jià)，臨床癥狀和發(fā)病率是最表觀(guān)的指標(biāo)。臨床癥狀主要包括咳嗽和呼吸困難兩項(xiàng)［4］。Nathues H等［5］對(duì)59個(gè)育肥豬群的咳嗽次數(shù)以及血清抗體和支氣管肺泡灌洗液病原檢出率進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)在育肥群中咳嗽次數(shù)的統(tǒng)計(jì)，尤其是干咳次數(shù)的統(tǒng)計(jì)有時(shí)可以替代Mhp的PCR病原檢測(cè)。劉茂軍等［6］在豬支原體肺炎活疫苗(168株)免疫效益的研究中，分別統(tǒng)計(jì)了哺乳期、保育期和育肥期的發(fā)病率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)的三個(gè)豬場(chǎng)三個(gè)時(shí)期免疫豬的發(fā)病率均顯著下降。國(guó)外所有豬肺炎支原體凈化成功的案例，無(wú)一例外均需對(duì)凈化后豬群乃至后代的臨床癥狀進(jìn)行持續(xù)性的監(jiān)測(cè)［7］，甚至還引進(jìn)SPF級(jí)豬同群飼養(yǎng)，再觀(guān)測(cè)SPF級(jí)豬的臨床癥狀［8］，以達(dá)到更精確的結(jié)果。在國(guó)內(nèi)，邵國(guó)青［9］建議無(wú)豬支原體肺炎健康豬場(chǎng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)為:觀(guān)察3個(gè)月以上，未發(fā)現(xiàn)支原體肺炎癥狀并同時(shí)放入易感健康小豬2頭，同群飼養(yǎng)，也不被感染;一年之內(nèi)整個(gè)豬群未發(fā)現(xiàn)支原體肺炎癥狀，檢查所宰殺的肥豬、淘汰豬、死亡豬的肺部均無(wú)喘氣病病變，實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)病原陰性?？梢?jiàn)發(fā)病率的降低是豬支原體肺炎防控效果的最主要指標(biāo)之一。不僅是豬支原體肺炎本身，由于混合感染和繼發(fā)感染的存在，其他豬呼吸道疾病的發(fā)病率，特別是豬呼吸道疾病復(fù)合征發(fā)病率的降低，也可以作為評(píng)價(jià)豬支原體肺炎防控效力的主要臨床指標(biāo)之一。

1.2 肺臟病變?cè)u(píng)分 肺臟肉變?cè)u(píng)分主要有55分法和28分法兩種(見(jiàn)圖1)。55分法即Goodwin評(píng)價(jià)法［10］，根據(jù)不同肺葉所占的比例進(jìn)行病變程度打分，其中，每個(gè)心葉，尖葉最大值為10分，膈葉和副葉最大值為5分，最高55分。評(píng)定后將各肺葉評(píng)定的得分相加即為肺病變得分(不考慮各肺葉的大小)，分?jǐn)?shù)越高，肺炎癥面積越大，損傷越嚴(yán)重，其中5分為輕微，10分為中度，15分為重度，20分為嚴(yán)重。28分法即Madec和Kobisch評(píng)分法［11］，是根據(jù)對(duì)7個(gè)肺葉病變程度按豬支原體肺炎特異性損傷的肺葉面積(其中副葉只觀(guān)察腹面，其他6個(gè)肺葉腹面和背面均需觀(guān)察)占該肺葉表面積的比例進(jìn)行評(píng)定［11］，每個(gè)肺葉最高為4分，其中，無(wú)損傷為0，損傷面積占肺葉面積的1% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，大于75%為4分。各得分用如下公式進(jìn)行計(jì)算總得分:(各肺葉背面觀(guān)察得分之和+各肺葉腹面觀(guān)察得分之和)/2+副葉觀(guān)察得分。最終結(jié)果進(jìn)行四舍五入取整，最大得分為28分。肺部病變積分對(duì)于平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率有直接聯(lián)系，特別在與其它病原混合感染后可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部病變。這些評(píng)價(jià)系統(tǒng)可用于呼吸系統(tǒng)疾病的流行情況調(diào)查以及疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。

圖1 肺臟肉變?cè)u(píng)分圖

1.3 效益核算 豬支原體肺炎控制和凈化的中效益核算指控制前后豬場(chǎng)所增加的收入和所增加的成本之差。其中成本的核算較為簡(jiǎn)單，主要涉及所用的疫苗和藥物，增加的人工、設(shè)備和建筑，清群的豬群等。然效益的評(píng)估和計(jì)算較為復(fù)雜，其主要評(píng)價(jià)指標(biāo)除了豬支原體肺炎及其他呼吸道疾病的發(fā)病率和死亡率的減少之外［11］，料肉比，平均日增重［13］和出欄時(shí)間也是評(píng)價(jià)豬支原體肺炎控制和凈化的主要指標(biāo)之一。Bara［14］在進(jìn)行瑞士減群法凈化豬支原體肺炎的評(píng)價(jià)中，統(tǒng)計(jì)了一個(gè)豬場(chǎng)凈化前后連續(xù)四年的平均日增重和出欄時(shí)間，發(fā)現(xiàn)四年內(nèi)育肥豬的平均日增重從凈化前的585 g上升到713 g，出欄時(shí)間從凈化前的179 d下降到141 d，而每年豬氣喘病的控制和凈化費(fèi)用從最初的每頭母豬87.2澳元/年逐漸下降到0澳元/年。Tzivara A等［15］將臨床癥狀，酮體重和出欄屠宰后的肺臟病變作為使用豬肺炎支原體滅活疫苗后的評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)監(jiān)測(cè)的豬場(chǎng)雖然未觀(guān)察到臨床癥狀，但免疫組比非免疫組的酮體重分別重6 kg和4 kg。這些數(shù)據(jù)表明料肉比，平均日增重和出欄時(shí)間作為豬支原體肺炎防控和凈化的效益指標(biāo)比臨床癥狀的觀(guān)察更為精確。

1.4 血清學(xué)檢測(cè) 在未使用疫苗免疫的情況下控制和凈化豬支原體肺炎，血清中豬肺炎支原體特異性抗體的下降也可作為評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。Ciprián A等［4］在口服氟苯尼考控制人工感染豬肺炎支原體的療效研究中發(fā)現(xiàn)，口服氟苯尼考組的血清抗體在30日齡時(shí)相比未加藥物組顯著降低。Yeske E［16］采用全群注射泰拉菌素的方法凈化豬肺炎支原體的評(píng)價(jià)方法有臨床癥狀，育肥豬出欄前的血清抗體濃度，達(dá)到?jīng)]有臨床癥狀，血清抗體皆為陰性時(shí)判定為凈化成功。這些均表明在未使用疫苗免疫的情況下血清豬肺炎支原體特異性抗體濃度的降低可作為豬支原體肺炎控制和凈化效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.5 豬肺炎支原體病原檢測(cè) 豬支原體肺炎控制和凈化后，肺炎支原體病原的檢測(cè)是最根本的指標(biāo)。病原檢測(cè)方法有各種PCR法，免疫組化法，免疫熒光法等等。其中套式PCR法和熒光定量PCR法檢測(cè)最為敏感，且樣品的采集部位有鼻拭子、口咽拭子、氣管拭子、氣管灌洗液和肺組織等多種［17］，可根據(jù)具體情況選擇不同的采樣部位進(jìn)行采樣。Fablet C等［18］用鼻拭子、口咽拭子、支氣管拭子和支氣管肺泡灌洗液這四種方法對(duì)同一批豬進(jìn)行活體采樣，分別用套式PCR和熒光定量PCR檢測(cè)豬肺炎支原體以探討四種方法的敏感性，發(fā)現(xiàn)支氣管拭子和支氣管灌洗液敏感性較前兩者高，說(shuō)明檢測(cè)豬肺炎支原體，支氣管采樣是比較好的部位，但這兩種方法的樣品采集較為復(fù)雜，一般適合個(gè)體樣本的采集，群體樣本采集鼻拭子較為常用。Tamiozzo PJ［19］在瑞士減群法凈化豬肺炎支原體后對(duì)其后代的監(jiān)測(cè)上，采用了血清抗體和病原檢測(cè)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，先間隔一定時(shí)間采集血清和鼻拭子分別進(jìn)行ELISA和N-PCR檢測(cè)，到150日齡時(shí)屠宰豬如果發(fā)現(xiàn)有肺部病變，再用免疫組化法進(jìn)行病原檢測(cè)，可見(jiàn)病原檢測(cè)在豬支原體肺炎控制和凈化評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要地位。

2 疫苗免疫后的免疫學(xué)評(píng)價(jià)方法

疫苗免疫是豬支原體肺炎控制和凈化的關(guān)鍵措施之一，臨床上也需要對(duì)疫苗使用前后的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行充分的評(píng)估和效益分析，才能更好的指導(dǎo)疫苗的臨床應(yīng)用。除了上述常規(guī)評(píng)價(jià)方法之外，各種免疫學(xué)指標(biāo)也是疫苗免疫獨(dú)特的評(píng)價(jià)內(nèi)容。目前市場(chǎng)上有滅活疫苗和弱毒活疫苗兩種豬肺炎支原體疫苗，由于這兩種疫苗的主要免疫機(jī)理有所不同，故評(píng)價(jià)參數(shù)的側(cè)重點(diǎn)也有所不同。

2.1 滅活疫苗以體液免疫為主的評(píng)價(jià)方法 接種豬肺炎支原體滅活疫苗能夠降低肺炎的發(fā)生率、影響血清抗體生成量。Villarreal等［20］在5種豬肺炎支原體滅活疫苗免疫效果的研究中發(fā)現(xiàn)雖然所有疫苗組肺部肉變指數(shù)與對(duì)照組相比差異均不顯著，但這些苗均能引起豬肺炎支原體特異性抗體的升高。Reynolds SC等［21］在研究豬支原體肺炎滅活疫苗療效的試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)無(wú)論是陰性場(chǎng)還是陽(yáng)性場(chǎng)，用過(guò)疫苗的試驗(yàn)組抗體滴度均比非免疫組高。這些結(jié)果均表明滅活疫苗免疫后以血清抗體的升高作為其主要評(píng)價(jià)指標(biāo)較為敏感。雖然滅活苗依靠佐劑也能激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫，引起一些細(xì)胞因子的變化［22］，然而，檢測(cè)這些指標(biāo)的代價(jià)昂貴，且針對(duì)性差，所以除人為試驗(yàn)以外，臨床上基本不把細(xì)胞因子的變化作為豬肺炎支原體滅活疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.2 弱毒活疫苗以黏膜免疫為主的評(píng)價(jià)方法

豬肺炎支原體弱毒活疫苗的免疫途徑為肺內(nèi)注射，以激發(fā)機(jī)體的黏膜免疫和細(xì)胞免疫為主。Feng ZX等［23］建立了上呼吸道豬肺炎支原體特異性可溶性IgA(sIgA)的ELISA檢測(cè)方法，敏感度高，且鼻拭子采樣即可，操作簡(jiǎn)單。后來(lái)Feng ZX等［24］通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了免疫豬支原體肺炎活疫苗(168株)后sIgA濃度顯著升高，臨床癥狀及肺部病變顯著下降，說(shuō)明sIgA可以作為評(píng)價(jià)弱毒活疫苗免疫效力的主要指標(biāo)。

3 氣溶膠中豬肺炎支原體檢測(cè)指標(biāo)的應(yīng)用前景

作為呼吸道傳播的疾病，將氣溶膠檢測(cè)豬肺炎支原體作為豬場(chǎng)氣喘病的診斷和陰性群判定指標(biāo)的研究已初見(jiàn)端倪。Dee S和Otake S等［25-27］都利用液體氣旋式采樣器檢測(cè)空氣中的Mhp氣溶膠，以此來(lái)判定豬肺炎支原體的陰陽(yáng)性。所以豬場(chǎng)在豬支原體肺炎的防控和凈化中，如未用豬支原體肺炎弱毒活疫苗，豬舍單位體積空氣中的豬肺炎支原體濃度的下降可能可以作為豬支原體肺炎防控效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。目前，豬肺炎支原體強(qiáng)毒株和商品化的豬支原體肺炎弱毒活疫苗(168株)的分子生物學(xué)鑒別診斷雖未見(jiàn)報(bào)道，但商品化弱毒疫苗豬支原體肺炎(168株)的全基因序列已經(jīng)測(cè)出［28］，如能通過(guò)病原檢測(cè)的方法區(qū)分豬肺炎支原體野毒株和弱毒疫苗株(168株)，豬舍內(nèi)氣溶膠中野毒株和疫苗株濃度的變化將可能成為一個(gè)較好的豬支原體肺炎弱毒活疫苗的免疫評(píng)價(jià)參數(shù)。

4 結(jié)語(yǔ)

豬場(chǎng)進(jìn)行豬支原體肺炎的控制和凈化，其根本目的是經(jīng)濟(jì)效益，所以進(jìn)行各種防控措施前后，必須對(duì)防控措施的效益進(jìn)行詳細(xì)的評(píng)估。不同防控措施的具體評(píng)價(jià)指標(biāo)略有不同，以藥物控制為主要措施的評(píng)價(jià)指標(biāo)有:豬支原體肺炎及其他呼吸道疾病的發(fā)病率和死亡率的減少，育肥豬平均日增重的增加，存欄時(shí)間的減少，血清抗體滴度的變化，豬肺炎支原體病原的減少等等。以疫苗免疫為主的評(píng)價(jià)指標(biāo)除了上述指標(biāo)之外，各種免疫學(xué)指標(biāo)如血清抗體滴度，上呼吸道可溶性IgA濃度的增加等等。所以，進(jìn)行經(jīng)濟(jì)效益評(píng)價(jià)時(shí)一定要細(xì)致和全面，并進(jìn)行必要的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

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