王小飛，李繼昌，孫 博，王鳳霞，代重山，孫美成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

乳房炎涂膜劑是本實(shí)驗(yàn)室自行研制的中藥制劑。本品由蒲公英、紫花地丁等十種中藥組成，具有清熱解毒、活血散瘀、消腫散癰、排膿通絡(luò)之功效，主治乳癰初期、紅腫熱痛、癰疽黃腫，適用于奶牛、豬等家畜臨床型、隱性型乳房炎及乳頭炎、乳房腫塊等病癥，及化膿、蓄膿、乳房紅腫熱痛、機(jī)械性和吮吸性損傷引起的乳房皮溫升高、乳汁不下等乳房疾?。?］。

蒲公英為方中君藥，干燥品中蒲公英含量在15%以上，其活性成分主要為咖啡酸，故選用咖啡酸為含量指標(biāo)，采用HPLC法對(duì)乳房炎涂膜劑進(jìn)行質(zhì)量控制。此方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性好。

1 儀器、材料與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀系統(tǒng)，515雙泵，2998光二極管陣列檢測(cè)器，7725Ⅰ進(jìn)樣閥，Empower中文色譜工作站;KQ-100 E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 材料與試藥 咖啡酸對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):110885-200102;乳房炎涂膜劑，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理教研室自行研制;試驗(yàn)用水為超純水;甲醇，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，冰醋酸，分析純，哈爾濱市新達(dá)化工廠。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Symmetry shieldTMC18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 -1%冰醋酸溶液(20∶80)，體積流量為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為35℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備［2］精密稱(chēng)取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品2 mg置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，制成每毫升含80 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液［3］精確量取乳房炎涂膜劑10 mL，于50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理 20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取按處方量稱(chēng)取除蒲公英外陰性樣品，按照供試品溶液項(xiàng)下的方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專(zhuān)屬性考察 按上述色譜條件，分別對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，典型的色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，陰性對(duì)照品溶液中無(wú)咖啡酸吸收峰，咖啡酸與相鄰峰的分離度均大于1.7，理論塔板數(shù)按咖啡酸計(jì)算不低于3000［4］。

圖1 咖啡酸的HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系的考察 精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 mL 于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容后，得 8、16、24、32、40 μg/mL 的對(duì)照品溶液，用 0.22 μm 的濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣小瓶中，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)峰面積，以峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度進(jìn)行回歸，求得回歸方程A=44509C-40187，r2=0.9989。表明咖啡酸在8～40 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 對(duì)同一份咖啡酸對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果為1.10%，表明該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為120301的樣品，制成供試品溶液，分別于 1、2、4、6、8、10、12、14、16 h 進(jìn)樣，記錄咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算得RSD為0.56%。表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào):120301)，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其RSD為0.34%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已測(cè)知咖啡酸質(zhì)量濃度的乳房炎涂膜劑的供試品溶液6份，分別加入8.09、15.88 μg/mL 的咖啡標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表1所示。

表1 咖啡酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 取 3批樣品(批號(hào):120301、120302、120303)，制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄咖啡酸峰面積，外標(biāo)法計(jì)算咖啡酸含量，結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中咖啡酸含量的測(cè)定結(jié)果(n=5)

3 討論

目前HPLC法測(cè)定咖啡酸的含量使用的流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液。高效液相色譜的色譜柱與泵都是高精密度的分析部件，磷酸鹽無(wú)論在甲醇還是乙腈中的溶解度都很小，因此在含磷酸鹽的流動(dòng)相體系中，容易有磷酸鹽晶體析出，就會(huì)發(fā)生堵柱或堵泵的現(xiàn)象［5-6］。本方法使用冰醋酸為洗脫流動(dòng)相，避免了對(duì)色譜柱及色譜系統(tǒng)的損害［7］。該方法能精確定量乳房炎涂膜劑中的咖啡酸含量，用上述方法測(cè)得的色譜圖中咖啡酸峰的峰形較好，與其他組分均可達(dá)到基線分離、空白對(duì)照無(wú)干擾，該方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、加樣回收率試驗(yàn)均符合《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定，能有效控制乳房炎涂膜劑的咖啡酸含量。

［1］張秀英，王 新，劉芳萍，等.治療奶牛乳房炎中藥透皮軟膏及其制備方法:中國(guó)，CN101342243［P］.2009-01-14.

［2］晏 媛，劉世霆，許重遠(yuǎn)，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定蒲公英中咖啡酸和阿魏酸的含量［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué):2006，23(3):229-231.

［3］張秋紅，張忠義，李德平，等.反相高效液相色普法測(cè)定燒傷涂膜中黃芩苷和大黃素的含量［J］.醫(yī)學(xué)研究生報(bào)，2008，21(3):235-241.

［4］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版［M］.北京:化學(xué)化工出版社，2010:附錄29.

［5］韓錦屏，王愛(ài)華，朱文彬.液相色譜儀日常使用注意事項(xiàng)［J］.中國(guó)計(jì)量，2009，(6):75-76.

［6］章志青.含鹽流動(dòng)相損壞色譜柱原因分析［J］.四川化工，2009，12(5):41-43.

［7］ 施夏蓉，楊聰斌，洪清華.基于Taguchi和ANOVA方法的HPLC中藥成分檢測(cè)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)［J］.海峽藥學(xué)，2008，20(8):45-47.