李金強，沙美蘭，李曉玉，尹大路

(煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺 264000)

黃霉素(Flavomycin)又名斑伯霉素、莫諾霉素［1-2］，至少含有5種活性成分，以黃霉素A為主，其分子量為1582，主要對革蘭氏陽性菌有抗菌作用［3-7］。中國于1993年允許使用，目前在養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛應用，早在2005年歐盟農(nóng)業(yè)部長會議就決定，黃霉素等四種抗生素自2006年起禁止使用，其他許多國家也相繼出臺了禁用規(guī)定［8-9］。目前檢驗檢疫部門已將黃霉素列為飼料和動物源性食品殘留監(jiān)控計劃，因此該方法的制定將為飼料中黃霉素檢測及監(jiān)控計劃提供技術支持。由于黃霉素預混劑主要成分為黃霉素A，含量大于總活性的成分的 50%［10］，農(nóng)業(yè)部獸藥質量標準中也有規(guī)定［11］，可以通過檢測黃霉素A的含量間接監(jiān)控樣品中黃霉素的添加量。黃霉素對動物骨骼的發(fā)育有影響，大量攝入對造血功能有損害，其對動物及人體的其他危害尚在研究中［12-14］。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 分析天平(感量0.1 mg);6490液相色譜-串聯(lián)質譜儀ESI源(美國安捷倫公司);固相萃取裝置;milli-Q超純水系統(tǒng);0.45 μm濾膜;漩渦混合器;離心機(安亭)。500 mg/6 mL HLB固相萃取柱，購自Waters公司;甲醇、乙腈均為色譜純，購自德國Meker公司;乙酸銨為分析純;實驗用一級水由Millipore超純水系統(tǒng)制備;乙酸銨溶液(10 mmol/L):稱取0.77 g乙酸銨加適量水溶解，最后定容至1000 mL，用前過0.45 μm的濾膜，現(xiàn)用現(xiàn)配;提取液:25%氨水+甲醇(1+9)體積比。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃霉素A標準溶液 黃霉素標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，為預混劑，含量 8.0%，C 13655300，Lot:91105。稱取相當于含黃霉素A的標準品50 mg(準確至0.1 mg)的預混劑，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成濃度為1000 mg/L的標準儲備液，儲存于-18℃冰箱中(保存期6個月)，標準工作液和系列標準工作液根據(jù)需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品處理 樣品充分混勻后，稱取5 g(精確至0.1 g)，置于50 mL離心管中，準確加入提取液15 mL，蓋好試管蓋，在漩渦混合器上混勻2 min，5000 r/min離心5 min。將上清液轉移到另一個離心管中，殘渣中加入15 mL提取液，重復操作一次，合并兩次上清液，混勻備用。對于含油脂高的動物性飼料，將5 mL正己烷加入到提取液中，漩渦混合2 min，靜置分層后棄去上層正己烷層。準確移取15 mL上清液，于旋轉蒸發(fā)儀上45℃水浴蒸發(fā)至近干，加1 mL甲醇15 mL水溶解殘渣，充分混勻后注入經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水預先活化的HLB柱，控制過柱速度不超過1 mL/min，待樣液全部流過凈化柱后，用5 mL水淋洗柱子，抽干2 min后，用2 mL氨水甲醇(9+1)洗脫，洗脫液經(jīng)氮氣吹至近干，用甲醇定容至1 mL，充分混勻后10000 r/min離心10 min，取上清液過0.25 μm的濾膜，濾液供質譜測定。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱:Agilent Ecillps C18 150 mm ×2.1 mm，內徑1.7 μm，或相當者;柱溫 25℃;流動相:A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫(表 1);流速 0.3 mL/min;進樣量 10 μL。

表1 流動相梯度參數(shù)

1.2.4 質譜條件 離子源:ESI源;掃描方式:負離子模式(negative);檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM);霧化氣溫度:350℃;毛細管電壓:4.0 kV;離子駐留時間:200 ms;碰撞能(CE值):22;碎裂電壓(fragmentor):135;選擇離子:m/z 789.9/553.8(定性離子)，m/z 789.9/575.7(定量離子)。

2 結果與分析

表2 不同提取試劑黃霉素A的檢測結果(n=5)

2.1 提取試劑與凈化條件的選擇 由于黃霉素為強極性化合物，易溶于水，在提取方式的選擇上，文獻中采用超聲提取的方式［1］，試驗中采用漩渦混合和水浴超聲兩種提取方式進行了對比，對同一添加濃度的樣品，提取時分別采用漩渦混合2 min和超聲10 min，結果兩種方法的回收率沒有顯著差別，但漩渦混合節(jié)約提取時間。提取溶劑的選擇上，有文獻采用甲醇甲酸銨提?。?］，也有用氨水甲醇提?。?］，對此方法設計了三種不同的提取試劑組合，結果見表2，由表2可見，三種不同的提取試劑組合中，1+9的氨水甲醇平均回收率為93.4%，其他的最高只有87.6%，因此選擇1+9的氨水甲醇作為飼料中黃霉素A檢測的提取試劑。凈化方法上，由于飼料成分復雜，基質干擾嚴重，在這種情況下，對一低濃度添加樣品(500μg/kg)設計了4種不同的凈化方法，一是過C18固相萃取柱，甲醇洗脫［2］;二是過HLB凈化柱，氨水甲醇洗脫［1］。結果見表3，由表3可見，提取液經(jīng)HLB柱凈化所測得的黃霉素A的回收率高，幾乎無基質干擾，所以選用500 mg/6 mL HLB柱作為凈化柱。

表3 兩種不同的凈化柱對黃霉素A凈化提取的回收率(n=5)

以固體飼料為例，稱樣5 g，30 mL試劑提取一次。

2.2 質譜條件的確定 選擇質譜條件時，發(fā)現(xiàn)黃霉素A在電離時產(chǎn)生兩個母離子，即［M-H］-m/z 1580.7 和［M-H］2-m/z 789.9 見圖 1，離子［M-H］2-m/z 789.9的響應值較高，所以用選用［M-H］2-為檢測母離子，其子離子分別為 m/z 575.7(定量離子)和 m/z 553.8(定性離子)，子離子掃描TIC圖見圖2，MRM質譜色譜圖見圖3。

2.3 方法的線性范圍與檢出限 移取一定量的黃霉素A標準工作液，用甲醇稀釋成100、250、500、1250、5000 μg/L 的系列標準工作液，每次進樣10 μL進行測定，以質量濃度x為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準工作曲線，線性圖見圖4，結果表明黃霉素A在該濃度范圍線性良好，線性方程為Y=37.0145x-269.2284，相關系數(shù) r=0.999725。以S/N=3所對應的黃霉素A的含量30 μg/kg，作為方法的檢出限(LOD)，以S/N=10所對應的黃霉素A的含量100 μg/kg，作為方法的最低定量限(LOQ)。

圖3 黃霉素A標準(MRM)質譜色譜圖

圖4 線性圖

2.4 方法的回收率和精密度 為了確定方法的回收率和精密度，在動物性飼料和植物性飼料兩種基質中進行了不同濃度的黃霉素A添加回收試驗，結果見表4。由表4可見，兩種基質添加樣品的測定結果平均回收率均在70%以上，批內及批間相對標準偏差均小于10%，說明該方法有良好的精密度。

3 結論

檢測過程中的提取和凈化是關系到方法回收率和檢出限的關鍵所在，對方法的準確度和精密度均有較大的影響，另外儀器條件的選擇也關系到方法的靈敏度和檢出限。本項目在參考文獻的基礎上，經(jīng)過優(yōu)化，建立了飼料中黃霉素A的液相色譜串聯(lián)質譜檢測方法，方法簡便，數(shù)據(jù)重復性好，檢出限和定量限均能滿足日常檢測的要求，適合飼料中黃霉素A的測定。

表4 方法的回收率和精密度

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