張 麗，張 萍，石彥鵬，馬 燕

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所，銀川 750101)

泰樂菌素(Tylosin)是由弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生的一類大環(huán)內(nèi)酯禽畜專用抗生素。廣泛應(yīng)用于畜禽支原體疾病，細菌性疾病及螺旋體病和寄生蟲病的防治。特別是其強烈的抗支原體特性，使其成為治療畜禽支原體病的首選藥物，而且對禽、畜的生長有明顯促進作用，并且不殘留［1］。被國內(nèi)外廣泛用作為飼料添加劑，是國家規(guī)劃重點發(fā)展的獸藥產(chǎn)品［2］。

在現(xiàn)有的泰樂菌素生產(chǎn)中，所用的斜面培養(yǎng)基多為麩皮培養(yǎng)基，而麩皮的質(zhì)量、品種的變化以及制作時不易掌握、甚至在每次配制時的煮沸、過濾等人為操作差異都會影響到斜面配比的穩(wěn)定。經(jīng)典的用于培養(yǎng)放線菌的高氏I號斜面培養(yǎng)基在斜面培養(yǎng)基配制中雖然質(zhì)量容易控制，較穩(wěn)定，但是斜面孢子生長需14～15 d，周期長，不太適合大規(guī)模生產(chǎn)。本文在原有高氏I號培養(yǎng)基配方中加入豆餅粉和酵母浸膏粉，通過單因子實驗和正交試驗設(shè)計［3］對斜面配方進行優(yōu)化，能夠兼具麩皮斜面生長快的優(yōu)勢，在生產(chǎn)中得到良好的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 泰樂菌素產(chǎn)生菌 TLⅡ10-1222#由寧夏泰瑞制藥股份有限公司提供。

1.1.2 試劑及原料［4］麩皮(取本地產(chǎn)紅皮小麥自制)，氯化鈷(天津市風船化學(xué)試劑科技有限公司)，硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸鎂(均為天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，魚蛋白胨、酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，酵母膏粉(英國進口)，玉米淀粉(通良萬順達生物科技有限公司)泰樂菌素標準品(中國獸藥監(jiān)察所)，玉米漿(華北康欣)，豆餅粉(中寧縣天合工貿(mào)有限公司)，魚粉(吳忠玉環(huán)有限公司)，玉米粉(寧夏泰瑞制藥股份有限公司)，玉米蛋白粉(內(nèi)蒙阜豐)，氯化鉀(俄羅斯)，硫酸鎳(陵縣匯豐鈷業(yè))，鹽酸甜菜堿(濰坊祥維斯化學(xué)品有限公司)，磷酸氫二銨(什邡市百盛化工有限公司)，碳酸鈣(永登天玉化工有限公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 旋轉(zhuǎn)搖瓶機，型號XDW25/96，四川長征制藥機械廠;紫外可見分光光度計，型號752N，上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫恒濕控制系統(tǒng)，型號BUH-03B/BUH-03A，蘇州市北冰洋空調(diào)設(shè)備有限公司、凈化工作臺，型號YJ-HS-2，無錫市榮豐凈化空調(diào)設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

1.2.1.1 斜面培養(yǎng)基的制備:麩皮斜面培養(yǎng)基的制備，參見寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業(yè)內(nèi)控標準。將麩皮用純化水煮沸30 min，過濾取汁，加入魚蛋白胨、氯化鈷、硫酸亞鐵、氯化鎂、硫酸鋅、瓊脂用純化水溶解后定容到所需體積，調(diào)pH為7.80～8.00，分裝于250 mL 茄瓶中，120 ℃滅菌30 min，冷卻至不燙手時鋪成斜面，凝固后，孵至表面無游離水。高氏I號斜面培養(yǎng)基的制備，將玉米淀粉用純化水溶解，加熱，糊化后，加入硝酸鉀、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、酵母膏粉、豆餅粉、瓊脂用純化水溶解后定容到所需體積，調(diào)pH為7.20～7.40，分裝于 250 mL 茄瓶中，在 120 ℃、0.11MPa下滅菌30 min，冷卻至約50℃鋪成斜面，凝固后，孵至表面無游離水。

1.2.1.2 種子瓶培養(yǎng)基、發(fā)酵瓶培養(yǎng)基制備參見參考文獻［4］。

1.2.2 接種培養(yǎng) 取沙土管保藏的生產(chǎn)菌種適量，加生理鹽水制備成孢子懸浮液，用玻璃棒蘸取菌懸液在茄瓶內(nèi)連續(xù)劃線，均勻密集地涂滿整個斜面。每種培養(yǎng)基各接斜面10瓶，置于恒溫室中培養(yǎng)，按照寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業(yè)內(nèi)控標準規(guī)定的條件分別培養(yǎng)至 7、8、9、10、11 d，分別觀察斜面孢子成熟度。

1.2.3 實驗方法

1.2.3.1 在高氏I號斜面培養(yǎng)基中分別添加豆餅粉、酵母膏粉、玉米漿進行單因子實驗。

1.2.3.2 結(jié)合單因素實驗結(jié)果對高氏I號斜面培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方中添加的酵母膏粉、豆餅粉及斜面孢子培養(yǎng)周期采用正交設(shè)計L25(56)的進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 在高氏I號培養(yǎng)基(對照組)中分別添加不同比例的豆餅粉、酵母膏粉和玉米漿，并與高氏I號、麩皮培養(yǎng)基斜面孢子同期對比，以發(fā)酵搖瓶酸化液的化學(xué)效價為數(shù)據(jù)測定標準，其實驗數(shù)據(jù)如下表1。

表1 豆餅粉、酵母膏粉和玉米漿加量在高氏培養(yǎng)基配方中的搖瓶效價

對比各實驗組結(jié)果及t值，帶*組即添加玉米漿各實驗組和高氏I號斜面組的平均效價低于麩皮斜面組，且t值均大于t界值表中相應(yīng)的 t值2.776 (α =0.05，t0.05/2，4)，其差異具有顯著性，可認為添加玉米漿不利于泰樂菌素菌種培養(yǎng)，故在后續(xù)添加實驗中舍去玉米漿各組。對豆餅粉和酵母膏粉的添加劑量和培養(yǎng)周期進行正交設(shè)計，以確定最佳組合。

2.2 對高氏I號斜面培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方中添加不同比例的豆餅粉(A)、酵母膏粉(B)及斜面孢子培養(yǎng)周期(C)按正交設(shè)計L25(56)進行優(yōu)化，正交設(shè)計表如表2。正交實驗結(jié)果如表3。

表2 因素水平表

表3 正交實驗結(jié)果

表3的實驗結(jié)果表明，19號實驗搖瓶效價最高，平均達到13959 u/mL，豆餅粉對搖瓶效價的影響比較大，為主要因子。通過直觀分析得出，斜面孢子培養(yǎng)基最優(yōu)配方和最佳培養(yǎng)周期為:A4B2C3，高氏I號培養(yǎng)基在基礎(chǔ)配方中添加1.0%豆餅粉和0.2%酵母膏粉，斜面培養(yǎng)至9 d效價最高，斜面孢子生長均勻，壓片鏡檢孢子量大，大部分成游離孢子。

2.3 在培養(yǎng)至第9 d，分別對麩皮斜面和優(yōu)化后的高氏I號培養(yǎng)基上的菌種進行壓片，經(jīng)美蘭染色后進行顯微鏡觀察(放大倍數(shù):1000×)，發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化后的高氏I號培養(yǎng)基上菌種成熟度明顯好于麩皮培養(yǎng)基，產(chǎn)生了大量的游離單孢子和鏈狀孢子，而麩皮培養(yǎng)基上仍為氣生菌絲。如圖1。

圖1 兩種培養(yǎng)基上菌種壓片鏡檢圖

3 討論

在高氏I號培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方中添加1.0%豆餅粉和0.2%酵母膏粉，能夠明顯改善原高氏I號培養(yǎng)基生長慢的現(xiàn)象，使斜面生長周期縮短至9 d，產(chǎn)生大量優(yōu)質(zhì)的孢子，夠達到麩皮培養(yǎng)基的菌體生長的速度，而且搖瓶效價高于麩皮培養(yǎng)基斜面。同時其制備過程中簡單，原材料質(zhì)量容易控制，有利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。優(yōu)化后的高氏I號培養(yǎng)基完全可替代麩皮培養(yǎng)基用于生產(chǎn)。

［1］田國泰.泰樂菌素在畜禽業(yè)上的應(yīng)用［N］.中國畜牧水產(chǎn)報，2001-03-04:第7版.

［2］史小麗.泰樂菌素的性能與應(yīng)用［N］中國畜牧水產(chǎn)報，2001-09-30:第4版.

［3］ 張紹鏞，嚴圣武，等.質(zhì)量管理中的試驗設(shè)計方法［M］.北京:北京理工大學(xué)出版社，1991:32-119.

［4］石彥鵬，張 麗，張 萍.硫酸亞鐵對泰樂菌素發(fā)酵的影響［J］.中國獸藥雜志［J］，2009，43(6):30-31.