趙肖霞，付全航，鄭愛(ài)文

(1.浙江省東陽(yáng)市人民醫(yī)院，浙江 東陽(yáng) 322100;2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 315300)

近年胰島素及其類(lèi)似物與癌癥的關(guān)聯(lián)性備受關(guān)注，德國(guó)、瑞典、英國(guó)和蘇格蘭的臨床回顧性研究提示某些胰島素類(lèi)似物的促有絲分裂效應(yīng)增加可能具有潛在的致癌作用［1-2］。而這種效應(yīng)主要由胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)受體介導(dǎo)，胰島素及其類(lèi)似物可激活胰島素受體和IGF-1［3］，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究探討胰島素在不同濃度和作用時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543生長(zhǎng)的增殖作用，為臨床使用提供依據(jù)。

1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)液、10%胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司);普通胰島素(丹麥Novo Nordisk公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國(guó)Sigma公司)，二甲亞砜(DMSO，美國(guó)Amresco公司)。

EPICSXL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter公司);MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo-Lab systems公司)。

人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-543)由浙江省腫瘤醫(yī)院病理科提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-543接種在含10%熱滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液內(nèi)，置37℃、5%CO2、飽和濕度孵育箱常規(guī)培養(yǎng)，用D-Hanks配制的0.3%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.3%胰腺蛋白酶消化并制成1×105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。更換無(wú)血清的培養(yǎng)液，加入胰島素使終濃度為1，5，10，20，40 mU/mL，平行設(shè)置空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)孔，繼續(xù)培養(yǎng)2，4，8，16，24，32 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，振蕩后繼續(xù)37℃、5%CO2孵育4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 200μL，振蕩5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。A值代表細(xì)胞增殖能力。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

MDA-MB-543細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，每皿3mL(含細(xì)胞5×105～1×106個(gè))，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)24 h，更換至無(wú)血清的培養(yǎng)基，加入胰島素使終濃度為1，5，10，20，40 mU/mL，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，離心5 min，棄上清后，細(xì)胞沉淀約0.5mL用70%乙醇2mL混勻重懸，4℃放置8 h以上，碘化丙啶(PI)染色，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。以同樣方法檢測(cè)10mU/mL 濃度組在胰島素作用2，4，8，16，24，32 h時(shí)的細(xì)胞周期分布。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以(±s)形式表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 胰島素對(duì)MDA-MB-543增殖的影響

在胰島素作用時(shí)間相同條件下，各時(shí)間點(diǎn)胰島素濃度在1～10mU/mL范圍內(nèi)，均隨胰島素濃度升高對(duì)MDA-MB-543增殖作用逐步增強(qiáng)，而之后逐漸減弱;而且，各時(shí)間點(diǎn)在10mU/mL時(shí)的A值與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.05或0.01)。在胰島素濃度相同條件下，各濃度在2～16 h范圍內(nèi)，均隨胰島素作用時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)MDA-MB-543增殖作用逐步增強(qiáng)，而之后逐漸減弱;而且，各濃度在作用8～16 h時(shí)的A值與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.05或0.01)。這提示胰島素能明顯促進(jìn)MDAMB-543的增殖，且具有明顯的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，在10mU/mL作用16 h時(shí)最強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 胰島素對(duì)MDA-MB-543增殖的影響(n=6，±s)Tab.1 Effect of Insulin on the proliferation of MDA-MB-543(n=6，±s)

表1 胰島素對(duì)MDA-MB-543增殖的影響(n=6，±s)Tab.1 Effect of Insulin on the proliferation of MDA-MB-543(n=6，±s)

與0 h比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01;與對(duì)照組比較:3 P＜0.05，4 P＜0.01Compared with 0 h:1 P＜0.05，2 P＜0.01;Compared with control group:3 P＜0.05，4 P＜0.01

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3.2 胰島素對(duì)MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響

在1～10mU/mL范圍內(nèi)，隨胰島素濃度增加，反映增殖活性的S期和G2/M期細(xì)胞比例均逐漸增多，而之后逐漸減少;而且，其中S期細(xì)胞比例在1～20 mU/mL范圍內(nèi)與對(duì)照組比較有顯著性差異(均P＜0.05或0.01)。在2～16 h范圍內(nèi)，隨胰島素時(shí)間延長(zhǎng)，反映增殖活性的S期和G2/M期細(xì)胞比例均逐漸增多，而之后逐漸減少;而且，其中S期細(xì)胞比例在2～24 h范圍內(nèi)與對(duì)照組比較有顯著性差異(均P＜0.05或0.01)。上述表明，胰島素的增殖作用主要作用于細(xì)胞周期S期，在1～10mU/mL、2～16 h范圍內(nèi)具有明顯的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，與MTT結(jié)果相符合。結(jié)果見(jiàn)表2～3。

4 討論

胰島素是一種蛋白質(zhì)激素，除重要的機(jī)體代謝調(diào)節(jié)作用外，促生長(zhǎng)作用也被大量體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)［4-6］。1967年Heuson等報(bào)道胰島素可加快小鼠乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖［7］。近年大量的流行病學(xué)調(diào)查資料發(fā)現(xiàn)［8］，高胰島素水平的人群更易發(fā)生乳腺癌，乳腺癌婦女的血胰島素、IGF-1水平明顯高于正常人群，并與乳腺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及生存率有密切相關(guān)。因此，胰島素促生長(zhǎng)作用與腫瘤發(fā)生危險(xiǎn)性之間的關(guān)系成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以在體外無(wú)血清培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543為靶細(xì)胞，排除外源因素干擾，采用MTT法評(píng)估胰島素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543的增殖狀況，并結(jié)合細(xì)胞周期分布檢測(cè)，以提高結(jié)果準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素能明顯促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-543的增殖，這種增殖作用在10mU/mL、作用16 h時(shí)作用最明顯，之后逐漸減弱，具有明顯的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。關(guān)于胰島素促進(jìn)增殖的機(jī)制，許多學(xué)者已進(jìn)行了深入研究。目前已經(jīng)確認(rèn)胰島素的生物效應(yīng)是通過(guò)一系列的蛋白激酶、磷酸酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，與細(xì)胞增殖有關(guān)的胰島素信號(hào)通路主要為Ras和磷脂酰肌醇3激酶途徑，而這兩條通路都必須由胰島素和胰島素緊密受體結(jié)合后才能激活酪氨酸激酶活性而發(fā)揮生物效應(yīng)［9］。研究證實(shí)［10］，多種腫瘤細(xì)胞(人肝細(xì)胞癌、乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤等)上胰島素受體存在異常過(guò)度表達(dá)及其親和力明顯增高。筆者認(rèn)為正因?yàn)槿绱?，胰島素在一定濃度范圍內(nèi)可與細(xì)胞膜上受體達(dá)到最大限度結(jié)合，從而發(fā)揮最大的促進(jìn)細(xì)胞分裂等生物學(xué)效應(yīng)，而超出此濃度范圍時(shí)，胰島素并不能直接發(fā)揮作用。同時(shí)，隨胰島素作用時(shí)間延長(zhǎng)，胰島素與其受體的復(fù)合物被內(nèi)吞入細(xì)胞，被特異性的降解酶所降解，從而停止其生物效應(yīng)［11］。

細(xì)胞周期分布檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述幾點(diǎn)，并顯示胰島素主要作用于細(xì)胞周期S期。Mawson等［12］研究表明，胰島素可使CyclinD的表達(dá)異常增高，使細(xì)胞迅速通過(guò)G0/G1期限制點(diǎn)進(jìn)入S期，細(xì)胞周期加快，使細(xì)胞以更快的速度異常增殖。而有研究表明CyclinD的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［13］，上述這些因素都可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。但本實(shí)驗(yàn)MTT和細(xì)胞周期結(jié)果顯示，這種增殖作用具有的劑量和時(shí)間的依賴關(guān)系是在一定濃度和時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的，并且是短暫和可逆的。因此，我們認(rèn)為胰島素雖然能誘導(dǎo)MDA-MB-543細(xì)胞加快進(jìn)入細(xì)胞周期S期增殖，并呈明顯的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，但這種作用是短暫和可逆的，臨床應(yīng)用是安全的。這與田春桃等［14］的結(jié)論一致。但是否存在其他激活機(jī)制，胰島素類(lèi)似物是否具有相同的增殖作用及在靶向治療中的應(yīng)用等問(wèn)題值得進(jìn)一步探討。

表2 胰島素(作用16 h)濃度對(duì)MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響(n=6，±s)Tab.2 Effect of Insulin(action time 16 h)concentration on the MDA-MB-543 cell cycle(n=6，±s)

表2 胰島素(作用16 h)濃度對(duì)MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響(n=6，±s)Tab.2 Effect of Insulin(action time 16 h)concentration on the MDA-MB-543 cell cycle(n=6，±s)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with control group:1 P＜0.05，2P＜0.01

組 別 濃度/(mU/mL)細(xì)胞周期分布/%G0/G1 S G2/M對(duì)照組 － 56.4±1.2 30.8±1.0 12.8±1.2胰島素組 1 51.4±1.31 35.6±1.41 13.0±1.3 5 47.5±1.52 48.7±1.72 13.8±1.5 10 22.9±2.22 62.5±2.32 14.6±1.9 20 35.8±1.82 50.2±2.02 14.0±1.6 40 51.5±1.6 34.8±1.7 13.7±1.4

表3 胰島素(10mU/mL)作用時(shí)間對(duì)MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響(n=6，±s)Tab.3 Effect of Insulin(10mU/mL)time on the MDA-MB-543 cell cycle(n=6，±s)

表3 胰島素(10mU/mL)作用時(shí)間對(duì)MDA-MB-543細(xì)胞周期的影響(n=6，±s)Tab.3 Effect of Insulin(10mU/mL)time on the MDA-MB-543 cell cycle(n=6，±s)

與對(duì)照組比較:1 P＜0.05，2 P＜0.01Compared with control group:1 P＜0.05，2P＜0.01

組 別 作用時(shí)間/h細(xì)胞周期分布/%G0/G1 S G2/M對(duì)照組 － 56.3±1.2 30.6±1.2 12.7±1.1胰島素組 2 52.4±1.31 34.6±1.41 13.0±1.3 4 47.2±1.51 39.6±1.61 13.2±1.5 8 39.5±1.72 46.5±1.82 14.0±1.7 16 23.9±2.22 61.3±2.52 14.8±1.9 24 52.6±1.61 43.8±1.71 13.6±1.4 32 55.5±1.1 31.5±1.1 13.0±1.2

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