帥 波 沈 霖 楊艷萍 謝 晶 周丕琪 徐曉娟 李成剛 伍滿香

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合骨科，武漢 430022

股骨頭缺血性壞死（ischemic necrosis of the femoral head，INFH）是嚴(yán)重影響人類健康的重要疾病之一。INFH為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之名，屬于中醫(yī)的“骨蝕”、“骨痰”、“骨痹”、“血痹”、“骨痿”等范疇。INFH 的治療關(guān)鍵為骨的修復(fù)和血管新生，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療早期INFH方面體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。補(bǔ)腎活血方為青娥丸加味而成，具有“補(bǔ)肝腎、益氣血、生髓骨”的功效，在治療早期INFH方面取得良效。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSC）的分化及其調(diào)控在股骨頭缺血性壞死的預(yù)防和治療中起著重要的作用，其相關(guān)研究近年來(lái)成為熱點(diǎn)［1］。本實(shí)驗(yàn)擬采用含藥血清干預(yù)的方法，探討補(bǔ)腎活血方對(duì)激素性INFH股骨近端骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的成骨分化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（transforming growth factor beta－1，TGF－β1）mRNA 的影響，從細(xì)胞及分子學(xué)角度探討補(bǔ)腎活血方治療激素性INFH的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

流式細(xì)胞儀（Becton－Dickinson，美國(guó)）、雙面超凈工作臺(tái)（國(guó)產(chǎn)）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Sheldon，美國(guó)）、倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）、紫外分光光度計(jì)（天津天光光學(xué)儀器有限公司）、LG－DMEM干粉培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（Gibco，美國(guó)）、胰蛋白酶干粉（Sigma，美國(guó)）、堿性磷酸酶試劑盒（上海虹橋醫(yī)用試劑研究所）、β－甘油磷酸鈉（Sigma，美國(guó)）、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白－2（recombinant human bone morphogenetic protein－2，rhBMP－2）（R＆D公司，美國(guó)）。

1.2 補(bǔ)腎活血方制劑的制備

補(bǔ)腎活血方為古方青娥丸加味制作：取杜仲（鹽炒）960g，補(bǔ)骨脂（鹽炒）480g，核桃仁（炒）300g，丹參480g，蒸大蒜240g，飲片洗凈，置多功能提取器中，加5倍量水浸泡2h后，加熱煎煮2h，藥液過(guò)濾，藥渣再水煎煮2次，每次1h，合并3次藥液，濃縮至稠膏狀（100%），趁熱倒入3倍量95%乙醇中，邊加邊攪拌，靜置24h后過(guò)濾。濾液回收乙醇，濃縮至每ml相當(dāng)于生藥2g，加1倍量蒸餾水，通過(guò)已轉(zhuǎn)成氫型并洗至中性的732型陽(yáng)離子交換樹脂（用量為藥材重量的25%，V／W）柱，有效成分被吸附于樹脂上，然后用2%氫氧化鈉洗脫，用10%鹽酸調(diào)整pH至7，濃縮，4℃冰箱冷藏備用。

1.3 含藥血清的制備

根據(jù)李儀奎［2］方法，取40只雄性SD大鼠（購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），隨機(jī)分為4組，每組10只。中藥組灌胃給藥，高濃度組給藥2.0 ml，中濃度組給藥1.0ml，低濃度組給藥0.5ml。每天1次，連續(xù)3d，在末次給藥2h后采血，分離血清，56℃滅活30min，過(guò)濾分裝，置－20℃冰箱備用。對(duì)照組按以上方法用生理鹽水1.0ml灌胃，制備普通血清。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，各組均采用終濃度為10%的不同血清。

1.4 BMSC的分離培養(yǎng)與鑒定

按李雄等［3］方法建立實(shí)驗(yàn)用激素性INFH大鼠模型，8只雄性SD大鼠，用醋酸強(qiáng)的松龍49mg／kg臀肌注射，每天1次，連續(xù)注射6d后，于第7天處死，抽取4～5ml骨髓，置入裝有DMEM培養(yǎng)液的20ml無(wú)菌離心管中，以Percoll（密度為1.073g／ml）為分離介質(zhì)，用梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。多次洗滌后重新懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3～5d后換液，去除未貼壁的細(xì)胞，每3d換液1次，每天觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁及生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。收集第3代BMSC，流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)CD34、CD90、CD44和CD45等抗原的表達(dá)。

1.5 細(xì)胞分組培養(yǎng)

將空白對(duì)照血清（A組）、補(bǔ)腎活血方含藥血清低（B組）、中（C組）、高（D組）濃度分別置于培養(yǎng)孔中，每孔均含rhBMP－2，取第3代BMSC，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／ml，每組加200μl細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)及細(xì)胞增殖測(cè)定

分別于培養(yǎng)第1、3、5、7、10、12和15天對(duì)四組細(xì)胞通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。每孔加MTT溶液200μl，37℃孵育4h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔內(nèi)加入1 000μl DMSO，振蕩10min裂解細(xì)胞，使結(jié)晶物充分融解，分光光度計(jì)于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD570值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 ALP活性檢測(cè)

分別于培養(yǎng)的第5、10、15和20天，將各組培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化后加入培養(yǎng)基1ml終止消化，離心洗滌后，加細(xì)胞裂解液，然后按ALP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行加樣操作，用分光光度計(jì)于520nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD，然后計(jì)算出ALP含量。

1.8 TGF－β1mRNA的測(cè)定

TGF－β1引物：根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物。TGF－β1引物為：fGTGCTCGCTTTGTACAACAGC，rTTACCAAGGTAACGCCAGG，擴(kuò)增片段為336bp，β－actin 引物為：fTCACCCACACTGTGCCCATCTACGA，rTCACCCACACTGTGCCCATCTACGA，擴(kuò)增片段為300bp。按試劑盒說(shuō)明，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃30s，60℃30s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物在1.5% 的瓊脂糖凝膠上電泳。紫外透射儀上檢測(cè)，凝膠成像儀攝像。求出每條目的條帶與β－actin條帶的比值，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析，結(jié)果以±s表示，同時(shí)應(yīng)用LSD及Dunnett－t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的鑒定

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：BMSC細(xì)胞表面主要陰性標(biāo)志物CD34和CD45均為陰性，陰性率分別為1.29%和2.51%，而BMSC細(xì)胞表面主要陽(yáng)性標(biāo)志CD44和CD90為陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為90.18%和92.63%，BMSC的濃度在90%以上。見(jiàn)圖1。

圖1 BMSC的鑒定圖

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，A、B兩組細(xì)胞增加較C、D組緩慢，細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，而C、D兩組中細(xì)胞在復(fù)合培養(yǎng)4h后可貼壁，呈現(xiàn)圓形或橢圓形；到第1天時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)分布均勻，呈長(zhǎng)梭形；到第3天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增殖增多，呈多角形或梭形；到第5天以后，細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增多，長(zhǎng)滿瓶壁，呈單層生長(zhǎng)，明顯優(yōu)于A、B兩組。見(jiàn)圖2。

圖2 BMSC培養(yǎng)10d時(shí)細(xì)胞黏附、增殖情況

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)的生長(zhǎng)曲線

隨著培養(yǎng)誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，四組細(xì)胞數(shù)量均提高，A、B、C三組細(xì)胞數(shù)量在第10天時(shí)達(dá)到高峰，后入平臺(tái)期。而D組在第10天后細(xì)胞數(shù)量緩慢升高。A、B兩組細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異（P＞0.05），而C組及D組從培養(yǎng)的第5天開始細(xì)胞數(shù)量明顯高于A、B組（P均＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)生長(zhǎng)曲線

2.4 細(xì)胞ALP活性檢測(cè)結(jié)果

隨培養(yǎng)誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組中細(xì)胞ALP活性均逐漸增高，第15天后，A、B組ALP活性逐漸趨緩，而C、D組仍逐漸增高，從第5天開始C、D組ALP活性明顯高于A、B組，第15天及第20天時(shí)，D組細(xì)胞的ALP活性明顯高于C組（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 細(xì)胞ALP活性檢測(cè)

2.5 TGF－β1mRNA的表達(dá)情況

A組 TGF－β1mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.563±0.083），B 組為 （0.631±0.096），C 組 為 （3.197±0.636），D組為（2.463±0.501），A、B兩組表達(dá)量明顯減弱，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C、D兩組TGF－β1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于A、B兩組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組TGF－β1mRNA表達(dá)

3 討論

INFH為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)難治性疾病之一，古代醫(yī)家認(rèn)為氣血對(duì)骨骼的滋養(yǎng)是骨骼維持正常形態(tài)和功能的關(guān)鍵。雖然歷代醫(yī)家對(duì)本病在病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)不盡相同，各有側(cè)重，但歸納起來(lái)不外乎腎虛、血瘀、痰濕等。治以補(bǔ)肝腎、益氣血、生髓骨、活瘀血、祛痰濕、止痹痛，使瘀凝祛而疼痛止，脈絡(luò)通而骨得養(yǎng)。INFH患者因腎虛或血瘀，導(dǎo)致骨枯髓減，骨髓功能下降，繼而分化為成骨細(xì)胞的能力及其活性也隨之下降，導(dǎo)致股骨頭局部骨壞死及再修復(fù)新生障礙。青娥丸加味是根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”原理，在傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥方青娥丸基礎(chǔ)上，加用活血中藥丹參，結(jié)合中醫(yī)傳統(tǒng)理論及經(jīng)驗(yàn)，從整體上調(diào)理肝腎，調(diào)節(jié)骨代謝，促進(jìn)骨形成及骨組織的修復(fù)，預(yù)防INFH進(jìn)一步發(fā)展。

骨髓間充質(zhì)細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多個(gè)方向分化，故骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中只有一部分是能自發(fā)分化為成骨細(xì)胞系的骨祖細(xì)胞，其在體外的分化很大程度上依賴于培養(yǎng)條件。故摸索MSC最佳體外培養(yǎng)條件使MSC多量、穩(wěn)定地向成骨細(xì)胞系分化，對(duì)骨組織的形成具有重要意義，一直以來(lái)是治療早期INFH良好的種子細(xì)胞［4］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一種存在于骨基質(zhì)中的糖蛋白多肽，含有二硫鍵結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量18 000～30 000，除BMP1外構(gòu)成了一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能相似的多肽因子家族［5］。BMPs能在生物體內(nèi)誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化成為軟骨和骨。BMPs各成員的誘導(dǎo)成骨能力不同，其中以BMP－2的成骨能力最強(qiáng)，是骨組織形成過(guò)程中最為關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子之一，可誘導(dǎo)人或動(dòng)物間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨或軟骨組織，因此目前被廣泛研究，中醫(yī)藥干預(yù)運(yùn)用也發(fā)揮著重要的作用［6］。

本文的結(jié)果顯示，rhBMP－2能夠誘導(dǎo)激素性INFH大鼠股骨近端分化中的 MSC表達(dá)TGF－β1mRNA，且一定濃度的補(bǔ)腎活血方含藥血清能夠促進(jìn)這種作用，其中中、高濃度可達(dá)本組的最大效應(yīng)。TGF－β1廣泛存在于正常組織中，尤其以骨組織中含量最為豐富。大量研究表明，TGF－β對(duì)骨質(zhì)再生起關(guān)鍵作用。TGF－β參與胚胎骨的形成和生長(zhǎng)，在骨形成的早期，新生的軟骨內(nèi)和骨膜中分別有TGF－β1和TGF－β2的表達(dá)。TGF－β1能促進(jìn)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞增殖分化及骨細(xì)胞增殖，在骨系細(xì)胞中主要表現(xiàn)為促進(jìn)間質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞DNA合成及增殖，可明顯促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，刺激膠原、骨連接素和骨橋蛋白合成，增加骨基質(zhì)沉積率。TGF－β1還能增加成骨細(xì)胞定向遷移的能力，這在骨修復(fù)過(guò)程中吸收成骨祖細(xì)胞向激活的骨吸收部位移動(dòng)，有重要的趨化作用［7］。筆者的前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，TGF－β1主要在成骨細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，體內(nèi)研究表明中藥補(bǔ)腎方能明顯提高成骨細(xì)胞TGF－β1的表達(dá)。筆者的研究還顯示青娥丸能夠提高骨質(zhì)疏松癥患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶－2、骨堿性磷酸酶、骨鈣素，Ⅰ型膠原交聯(lián)C端肽和尿Ⅰ型膠原交聯(lián)N端肽水平，從而間接反映青娥丸能夠有效增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成抑制骨吸收，增強(qiáng)骨質(zhì)骨量［9］。本研究結(jié)果顯示一定濃度的補(bǔ)腎活血方含藥血清能夠促進(jìn)分化中的MSC分泌ALP，通過(guò)對(duì)MSC形態(tài)學(xué)觀察、ALP活性測(cè)定等，均可說(shuō)明經(jīng)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞已經(jīng)具有與成骨細(xì)胞相似的形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn)。但補(bǔ)腎活血方的作用機(jī)制是通過(guò)增強(qiáng)rhBMP－2活性還是直接作用于靶細(xì)胞需要進(jìn)一步的觀察。

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