夏微光 杜艷軍 孫國(guó)杰 熊 萍 劉若蘭

湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430065

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，是一種老年人常見(jiàn)病。臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。如今人口老齡化已成為我國(guó)乃至全球性的社會(huì)問(wèn)題，因此對(duì)AD的防治亦日益受到人們的重視。AD患者腦神經(jīng)元的凋亡比正常人高出30～50倍，所以細(xì)胞凋亡是引起AD患者腦神經(jīng)元數(shù)目減少的重要原因之一［1］。近年來(lái)的研究［2］發(fā)現(xiàn)，AD病理的發(fā)展及與其相關(guān)的細(xì)胞凋亡是細(xì)胞周期調(diào)控異常所致神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞分裂周期失敗的結(jié)果。cyclinE與p21／cip這兩種細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的異常是導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂的物質(zhì)基礎(chǔ)和重要原因之一。已有越來(lái)越多的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［3－5］表明，針灸治療AD療效肯定。本研究旨在通過(guò)電針加艾灸同時(shí)治療AD模型大鼠，探討電針和艾灸的協(xié)同作用對(duì)AD大鼠海馬區(qū)cyclinE、p21／cip表達(dá)的影響，以進(jìn)一步闡明針灸防治AD的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

Wistar大鼠，雄性50只，鼠齡（10.0±2.0）個(gè)月，體重（360.0±20.0）g，SPF級(jí)（由湖北省疾控中心提供）。購(gòu)進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)，正常飲食、飲水，7d后即開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，剔除不合格者（即反應(yīng)過(guò)于遲鈍或靈敏者），將合格大鼠40只稱重后隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、治療組，每組10只。

1.2 儀器及試劑

Morris水迷宮軟件公司（MT－200Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司），顱腦立體定位儀（編號(hào)：89－00136，國(guó)營(yíng)西北光學(xué)儀器廠），微量注射器（寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠），BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。Aβ1－42（美國(guó)Sigma公司），兔抗大鼠cyclinE多克隆抗體（北京博奧森公司），兔抗大鼠p21／cip多克隆抗體（北京博奧森公司），生物素化山羊抗兔二抗工作液（北京中杉金橋公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），SDS－PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），生物素化山羊抗兔二抗工作液AP顯色液。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制作 參照劉靜等［6］的造模方法，將大鼠稱重，用10%水合氯醛（3.5ml／kg）麻醉后，按大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行定位，在前囟后3.3mm，中線左右各旁開(kāi)1.5mm，用牙科鉆鉆一小孔（直徑1mm），垂直插入微量注射器，使針尖自顱骨表面緩慢進(jìn)入3mm至海馬區(qū)，用微量注射器分別注入5μl聚集肽的 Aβ1－42（按試劑說(shuō)明，將0.1mg的 Aβ1－42單體用二甲基亞砜50μl溶解后，再加入0.01M的PBS 50μl稀釋配制成1μg／μl的溶液，37℃水浴箱孵育1周，使其變成寡聚狀態(tài)而具有神經(jīng)毒性，－20℃分裝保存）。5min內(nèi)注射完，注射后留針5min，按1.0 mm／min速度緩慢拔針，以免拔針時(shí)藥物溢出。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔，縫合皮膚，局部外敷青霉素G粉，并于術(shù)后3d內(nèi)（包括當(dāng)日）每日肌肉注射青霉素G粉10萬(wàn)單位預(yù)防感染。

1.3.2 處理方法 正常組：正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理，作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；假手術(shù)組：顱內(nèi)注射與Aβ1－42等量生理鹽水，余同模型組；模型組：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后即行造模，造模完畢后，大鼠正常喂養(yǎng)16d（以便藥物的吸收）后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)；治療組：造模完畢后，大鼠正常喂養(yǎng)3d后即行治療。取穴根據(jù)郭義［7］提供的大鼠穴位定位方法，針灸前將正常大鼠“百會(huì)”（頂骨正中）、“腎俞”（第2腰椎下兩旁）穴區(qū)直徑約1.5～2.0cm區(qū)域的鼠毛剪凈，暴露穴區(qū)皮膚，消毒，然后用1寸毫針對(duì)準(zhǔn)百會(huì)穴刺入，當(dāng)針尖刺到顱骨有阻力時(shí)調(diào)整方向，沿皮向后透刺約3～5mm，再用1寸毫針?lè)謩e對(duì)準(zhǔn)兩側(cè)腎俞穴向內(nèi)斜刺5mm，再把電針儀的正極接左側(cè)腎俞穴，負(fù)極接百會(huì)穴，開(kāi)始通電，強(qiáng)度1 mA，連續(xù)波，頻率2Hz，時(shí)間15min，次日改正極接右側(cè)腎俞穴。電針治療完畢后在上三穴上方2～3cm采用特制艾條（直徑6mm）施以溫和灸，使穴位表皮溫度在（43.0±1.0）℃，每穴持續(xù)15min。上述操作每日1次，6d為1個(gè)療程，療程間休息1d，共治療2個(gè)療程后次日進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。

1.3.3 標(biāo)本制備及檢測(cè)方法 將4組（每組10只）大鼠麻醉后快速斷頭取腦，剝離一側(cè)海馬稱重，剪碎置于勻漿器中，加入組織勻漿液（500μl裂解液加10μl PMSF加10μl磷酸酶抑制劑）置于冰盒中反復(fù)捻轉(zhuǎn)使組織盡量研碎，30min后轉(zhuǎn)入離心管，在4℃下12 000rpm離心30min，取上清采用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度。取80μg蛋白樣品放入97℃變性，用12%的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，剪取所需條帶，用含5%脫脂奶的TBST封閉1h，分別用兔抗cyclinE和兔抗p21／cip多克隆抗體（1∶100）孵育4℃過(guò)夜，用生物素化山羊抗兔二抗37℃孵育1h，AP顯色液顯色（取NBT、BICP液各4μl加入992μl的APbuffer中，滴在轉(zhuǎn)有目的蛋白的PVDF膜上，避光顯色），顯色充分后用清水中止。將目的條帶膜烘干保存，掃描后用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶吸光度（OD）值，對(duì)免疫印跡（Western blot）結(jié)果進(jìn)行分析。另外，增加內(nèi)參照蛋白β－actin的檢測(cè)（兔抗β－actin多克隆抗體，Santa Cruz，1∶200），cyclinE、p21／cip的OD值分別與β－actin的OD值的比值作為觀察指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，用SNK檢驗(yàn)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

以Maker所顯示的條帶對(duì)應(yīng)的分子量作為參照確定cyclinE蛋白（51kDa）、p21／cip蛋白（21kDa）和β－actin蛋白（43kDa）的位置，結(jié)果在相應(yīng)的位置都出現(xiàn)了棕色的陽(yáng)性反應(yīng)。見(jiàn)圖1。

圖1 cyclinE、p21／cip的表達(dá)（Western blot法）

用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶OD值，并與β－actin的OD值比較，結(jié)果顯示，cyclinE在模型組中的表達(dá)量明顯高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05），而治療組cyclinE表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05），且與正常組和假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組p21／cip表達(dá)明顯低于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05），治療組明顯高于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠cyclinE、p21／cip蛋白表達(dá)的比較（n＝10，%，±s）

表1 4組大鼠cyclinE、p21／cip蛋白表達(dá)的比較（n＝10，%，±s）

與模型組比較＊ P＜0.05；與正常組比較△ P＜0.05

組別 cyclinE p21／ci p 0.5449±0.0198 0.8958±0.0490假手術(shù)組 0.5744±0.0050＊ 0.7594±0.0685＊△ 模型組 0.6958±0.0654△ 0.3764±0.0495△ 治療組 0.5604±0.0385＊ 0.5432±0.0604正常組＊△

3 討論

AD的病理特征之一是大量神經(jīng)元丟失。AD引起神經(jīng)元喪失的主要機(jī)制是細(xì)胞凋亡，神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡假說(shuō)是AD病因病機(jī)學(xué)說(shuō)的重要組成部分［8－9］。細(xì)胞周期需要細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）三者的相互作用來(lái)調(diào)控，以保證細(xì)胞分裂正常進(jìn)行。AD患者腦內(nèi)正常的神經(jīng)細(xì)胞本來(lái)已停止分化，可長(zhǎng)期存活，處于不可復(fù)原的狀態(tài)，即G0期，不再參與細(xì)胞增殖。如果cyclin、CDK或CKI三者的平衡被打破，細(xì)胞就會(huì)重啟細(xì)胞周期，而一旦進(jìn)入有絲分裂后期出現(xiàn)障礙，致使細(xì)胞分裂失敗，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，形成細(xì)胞凋亡［10］。Vincent等［11］首先報(bào)道，在AD患者腦中存在重新進(jìn)入細(xì)胞周期的神經(jīng)元，由于CKI失活，導(dǎo)致G1／S控制點(diǎn)的失調(diào)。神經(jīng)元細(xì)胞一旦跨過(guò)G1／S控制點(diǎn)，就能夠進(jìn)行DNA的復(fù)制，并且能夠進(jìn)入G2期，但是細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，所以就啟動(dòng)凋亡程序，引發(fā)細(xì)胞凋亡。

cyclinE能使細(xì)胞越過(guò)G1／S期調(diào)控點(diǎn)，激活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb），使其釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2Fs，E2Fs再促進(jìn)cyclinE與CDK2結(jié)合形成cyclinECDK2復(fù)合體，后者進(jìn)一步磷酸化pRb，充分釋放E2Fs，促進(jìn)許多有關(guān)DNA復(fù)制的基因表達(dá)［12］。p21／cip屬于CKI中的一種，當(dāng)DNA損傷和細(xì)胞衰老時(shí)，一方面，它能結(jié)合并抑制 cyclinD－CDK4、cyclinECDK2、cyclinA－CDK2等復(fù)合物的磷酸化活性，使Rb低磷酸化不能釋放E2F而致DNA合成受限，導(dǎo)致細(xì)胞不能進(jìn)入S期，而停滯在G1期；另一方面，在p21／cip端有增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）結(jié)合域，能覆蓋其某些功能區(qū)，使PCNA不能與DNA聚合酶δ形成復(fù)合物，或?qū)е翫NA全酶復(fù)合物不能在DNA單鏈上滑動(dòng)，從而影響DNA的復(fù)制［13］。這樣就可以避免細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期失敗所導(dǎo)致的凋亡。

Aβ由淀粉樣前體蛋白（APP）裂解而來(lái)，Aβ可引起氧化應(yīng)激、Ca2＋內(nèi)流，進(jìn)而損傷線粒體，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)能障礙，激活凋亡相關(guān)蛋白和因子，致使細(xì)胞周期異常，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡或AD某種病理改變，發(fā)生AD。Aβ1－42疏水性強(qiáng)，更易聚集，更容易在特定腦區(qū)聚集沉積，導(dǎo)致AD中老年斑的形成［14］，所以本文用Aβ1－42蛋白片段復(fù)制AD大鼠模型的成功率比較高，技術(shù)也較熟練。

cyclinE表達(dá)于G1期，與CDK2結(jié)合后對(duì)細(xì)胞周期具有正性調(diào)控作用，而p21／cip有負(fù)性調(diào)控作用，這兩個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子表達(dá)紊亂可致細(xì)胞周期紊亂，因此本文通過(guò)檢測(cè)cyclinE、p21／cip在AD模型大鼠海馬中的含量以期進(jìn)一步闡明針灸治療AD的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，模型組cyclinE含量比正常組和假手術(shù)組升高，p21／cip含量比正常組和假手術(shù)組明顯減少。過(guò)多的cyclinE能使神經(jīng)細(xì)胞越過(guò)G1／S期調(diào)控點(diǎn)，激活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白以及其下游程序；p21／cip減少后不能抑制cyclin－CDK復(fù)合物的磷酸化活性，使得DNA能夠合成從而細(xì)胞進(jìn)入S期，同時(shí)PCNA與DNA聚合酶δ形成復(fù)合物，DNA大量復(fù)制，細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期，但在分裂后期失敗從而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。通過(guò)治療，cyclinE含量比模型組明顯降低，使細(xì)胞能維持在靜止?fàn)顟B(tài)，從而避免凋亡程序的啟動(dòng)；p21／cip含量比模型組明顯增多，它與大量的cyclin－CDK復(fù)合物結(jié)合導(dǎo)致DNA合成受阻，從而使細(xì)胞停滯在G1期，同時(shí)覆蓋PCNA某些功能區(qū)，阻止DNA的復(fù)制，防止細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期產(chǎn)生凋亡。結(jié)果還顯示，假手術(shù)組p21／cip的表達(dá)與正常組比較亦存在一定的差異，這可能與模型復(fù)制過(guò)程中大鼠海馬存在不可避免的輕微損傷有關(guān)，但與模型組比較仍存在一定的差異性（P＜0.05）；同時(shí)，針灸治療組與正常組比較也存在一定的差異，但與模型組比較有顯著的好轉(zhuǎn)（P＜0.05）。筆者認(rèn)為，就p21／cip蛋白而言，其未達(dá)到與正常組一致的水平可能與治療的療程或方法等有關(guān)，此點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。

中醫(yī)認(rèn)為，癡呆病位在腦，其根本病機(jī)為精、氣、血不足導(dǎo)致腦髓失養(yǎng)，故治療原則為培腎固本、益精填髓。腦居顱內(nèi)，主靈機(jī)、記憶，司智力意識(shí)，支配感覺(jué)，統(tǒng)帥全身。督脈為“陽(yáng)脈之?！?、“入屬于腦”，與腦髓關(guān)系很密切，故有“病變?cè)谀X，首取督脈”的說(shuō)法。百會(huì)穴屬督脈，居巔頂，手足三陽(yáng)、足厥陰等經(jīng)交匯于此，為“三陽(yáng)五會(huì)”，具有開(kāi)竅醒神、補(bǔ)腦益智之功。腎為先天之本，藏精、生髓，腎俞穴為腎之背俞穴，腎之精氣皆轉(zhuǎn)輸匯集于此，腎經(jīng)與督脈相通，共同入髓絡(luò)腦，共主一身陽(yáng)氣。故本實(shí)驗(yàn)電針“腎俞”能補(bǔ)益腎精，使精氣上注于腦，從而生髓益腦，電針“百會(huì)”可激發(fā)陽(yáng)氣，充養(yǎng)腦髓，提高記憶思維能力，艾灸上兩穴更可起到通經(jīng)活絡(luò)、益腎健腦之功。

綜上所述，電針加艾灸可以明顯改善AD模型大鼠海馬神經(jīng)元中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子表達(dá)的不平衡，減少神經(jīng)元的凋亡，對(duì)AD起到固本培元、填精益髓的治療作用。但在AD發(fā)生發(fā)展的不同階段，通過(guò)治療，使細(xì)胞周期正負(fù)調(diào)節(jié)因子間達(dá)到怎樣一個(gè)具體的平衡還有待進(jìn)一步研究。

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