張明達，李曉捷

腦性癱瘓(cerebral palsy,CP)是由于發(fā)育中胎兒或嬰兒腦的非進行性損傷所致持續(xù)性運動和姿勢發(fā)育異常、活動受限的一組綜合征[1]。常并發(fā)感覺、知覺、認知、交流、行為紊亂、癲癇、繼發(fā)性肌肉與骨骼問題。近年來，由于感染/炎癥與腦癱關系的研究取得很大的進展，臨床與流行病學資料都證實腦室周圍白質軟化(perivetricular leukomalacia,PVL)是腦癱的一個重要危險因素，而感染是導致PVL發(fā)生的原因[2]。大量研究證實，早期干預可通過一系列的機制促進腦損傷鼠的神經(jīng)行為學改變。髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)是免疫球蛋白超家族成員，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的一種髓鞘成分，并與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷關系密切[3]。它參與髓鞘的形成和維持并且在軸突生長方面起到重要作用。本研究應用免疫組化技術對早期干預后腦組織中MAG含量變化和運動功能改善情況進行相關性研究，從形態(tài)學、分子生物學和行為學方面揭示先天性腦損傷及功能恢復機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級雌性Wistar大鼠40只，體重220~250 g，雄性10只，體重250~300 g：大連醫(yī)科大學動物實驗中心；脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)，血清型055：B5：美國SIGMA公司；細胞免疫組化法(SABC法)試劑盒、兔抗鼠MAG多克隆抗體：北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 動物模型制備與分組 Wistar大鼠室溫(21±1)℃下常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食，適應環(huán)境2周后于17：00分兩批，每批雌鼠20只，按雌∶雄=2∶1合籠，第2天8：00查陰道涂片，如果查到精子記為妊娠0 d。孕鼠另籠飼養(yǎng)，分別在孕17 d、18 d對30只雌鼠(脂多糖組)腹腔注射脂多糖420μg/kg·d，另10只注射等量無菌生理鹽水。仔鼠出生后去除孕22 d前出生的仔鼠，取脂多糖組胎盤行HE染色，觀察宮內感染情況，判斷標準為組織中含有大量中性粒細胞浸潤。隨機抽取脂多糖組仔鼠100只分為干預組和非干預組各50只；選取生理鹽水組仔鼠(對照組)50只。

1.3 干預方法 干預組從出生后第1天開始進行早期干預，2周后康復訓練，非干預組和對照組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.1 早期干預 將1日齡干預組仔鼠托至掌心，給予不同強度和頻率的聲音和燈光刺激，同時用毛刷從前到后均勻有力的刷動，不能用力過大，防止產(chǎn)生疼痛。每天1次，每次20 min，持續(xù)至2周齡。

1.3.2 康復訓練 對15日齡干預組小鼠進行豐富環(huán)境刺激和康復訓練。每次30 min，每天1次。豐富環(huán)境包括轉盤、階梯、管道、秋千、斜坡和不同顏色和大小的球類等，每周改變環(huán)境兩次，持續(xù)至28日齡結束?？祻陀柧毎ㄆ胶饽居柧殹⑥D棒訓練和轉籠訓練等。

非干預組和對照組飼養(yǎng)于同樣大小的籠內，但不給予干預。

1.4 運動功能評定 分別用懸吊實驗[4]和改良BBB測試[5]于14 d、21 d、28 d對每組仔鼠進行運動功能評定。

1.5 取材 分別于出生后第1、7、14、21、28天對3組仔鼠各取6只行麻醉下心臟灌洗后斷頭，迅速取腦組織，甲醛溶液中固定。

1.6 MAG測定 各組石蠟包埋組織切片6張，片厚5μm，其中5張行MAG免疫組化染色，1張用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作陰性對照。

用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件計數(shù)MAG表達積分光密度(IOD)。每張切片隨機選取6個位置相應但不重復的視野均值作為該片IOD；每組選取6張切片。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。多組間比較采用單因素方差分析；組間均數(shù)比較采用t檢驗，方差不齊時組間均數(shù)比較采用t'檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 孕鼠分娩及仔鼠一般情況 脂多糖組孕鼠注射脂多糖后，進食及活動均明顯減少，精神狀態(tài)較生理鹽水組明顯萎靡，其中5只死亡，4只提前分娩，其余21只順利生產(chǎn)，共娩出仔鼠128只，死產(chǎn)13只。脂多糖組仔鼠身體顏色青紫，體重低，進食減少且精神萎靡，活動減少。生理鹽水組注射生理鹽水后無明顯異常，共娩出仔鼠103只，均為足月活產(chǎn)鼠，反應靈敏，顏色淡紅，體重正常。

2.2 子宮及胎盤檢測 脂多糖組孕鼠胎盤病理切片觀察見大量中性粒細胞浸潤，血管充血、水腫；生理鹽水組孕鼠胎盤未見異常。

2.3 神經(jīng)行為學檢測

2.3.1 懸吊試驗 與對照組比較，干預組和非干預組懸吊時間短(P<0.01)；但干預組測試得分明顯高于非干預組(P<0.01)。見表1。

2.3.2 改良BBB測試 14與21日齡干預組和非干預組得分明顯低于對照組(P<0.01)；干預組評分明顯高于非干預組(P<0.01)；28日齡干預組與對照組評分無顯著性差異(P>0.05)，非干預組評分明顯低于對照組(P<0.01)。見表2。

2.4 MAG 干預組和非干預組MAG表達IOD值均明顯高于對照組(P<0.01)；7日齡以后，非干預組明顯高于干預組(P<0.01)。見表3。

表1 不同日齡仔鼠懸吊實驗評分

表2 不同日齡仔鼠改良BBB評分

表3 不同日齡各組仔鼠腦白質MAG表達情況(IOD)

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在受到損傷后具有一定可塑性，即殘留部分腦組織結構和功能重建的能力，其中關鍵是軸突的再生。目前認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生障礙主要有兩個原因：①損傷神經(jīng)元存在再生能力缺陷；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)內微環(huán)境不適合其再生。其中抑制性因素被認為可能起更重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)再生抑制性髓鞘蛋白主要有MAG、Nogo和少突膠質細胞糖蛋白(OMGP)，還包括很多有膠質細胞神經(jīng)元本身產(chǎn)生的蛋白多糖和生長錐抑制因子以及細胞外分子等[6]。

表1、表2顯示，生理鹽水組的運動功能明顯好于腦損傷組，經(jīng)過早期干預和康復訓練的損傷組仔鼠運動功能提高顯著，而未經(jīng)訓練的損傷組仔鼠運動功能提高不明顯。但是隨著各組仔鼠日齡增加，其運動功能均有提高，這說明宮內感染所致仔鼠腦損傷為非進行性腦損傷；干預組仔鼠經(jīng)過早期干預和康復訓練后運動功能比非干預組提高明顯，也說明康復訓練這種形式對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后可塑性的提高起到了明顯促進作用。

表3顯示，在生理鹽水組中MAG的表達量要明顯低于損傷組，說明MAG在仔鼠出生時即有表達，在腦損傷后表達上調。干預組仔鼠表達量要低于非干預組，說明早期干預和康復訓練能抑制MAG的表達，從而促進腦損傷仔鼠腦組織結構和功能的恢復。在各組中MAG表達均是先增多后降低然后趨于穩(wěn)定，MAG在各組中均是在第7天表達達高峰，在21 d、28 d時逐漸降低。這與袁普衛(wèi)等[7]研究的MAG在急性脊髓損傷后的表達規(guī)律相一致。早期干預和康復訓練后MAG表達減少，提示運動功能的提高與腦組織中MAG的表達可能具有一定的相關性。

MAG作為一種髓鞘相關抑制蛋白，能夠抑制神經(jīng)元突起的生長和軸突的生長而且還可能影響軸突的結構，從而影響神經(jīng)元的功能[8]。通過以上實驗研究，我們可以初步推論，腦損傷后，MAG在短時間內的表達增高，阻礙了軸突和髓鞘的再生，這解釋了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后難以再生的部分原因，而采取干預措施后，MAG表達水平出現(xiàn)下降，這與臨床上早期干預及康復訓練的效果相符，這表明早期干預及康復訓練可能通過某種機制降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境中抑制因子的表達，從而改善神經(jīng)修復和再生的微環(huán)境，促進軸突和髓鞘的形成，增強了中樞神經(jīng)的可塑性，這很好的解釋了臨床上通過早期干預和康復訓練能夠改善腦癱及其中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關疾病癥狀的原因。

近年來對MAG的抑制作用機制的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營養(yǎng)因子p75NTR在轉導其抑制性效應中起到重要作用。Domeniconi等發(fā)現(xiàn)，MAG通過受控的膜內蛋白水解作用(RIP)先后經(jīng)過α和γ分泌酶兩次對p75NTR進行剪切，使其能釋放出胞內區(qū)(ICD)[9]，后者正是蛋白激酶PKC和小GTP酶Rho激活所必須的，由此啟動下游的信號來抑制軸突的生長，因此如果能阻斷該分泌酶的活性就很有可能阻斷NgR與MAG結合所導致的軸突生長抑制，這為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療提供了一個有效的靶點。另外，還有很多已經(jīng)被提出來的關于MAG的抑制作用的機制，但是目前仍缺少定論，所以對MAG的抑制效應和相應的作用機制及其信號轉導通路等方面還需要更深入的研究。

早期干預可使新生鼠皮層重量和厚度增加，神經(jīng)膠質細胞增生、突觸和樹突枝增多等，使受損傷腦通過產(chǎn)生非常規(guī)神經(jīng)突觸、樹突出現(xiàn)不尋常分叉、軸突繞道投射等途徑進行功能代償[10]可以提高新生鼠GABA受體的水平，增加突觸的飽和度[11]，可以提高腦內新環(huán)路調控的可塑性[12]?？祻陀柧毑坏軌虼龠M腦損傷功能區(qū)恢復，還可以促進樹突發(fā)芽，技巧平衡訓練可刺激突觸的增生，促進大腦皮質血管生成增多，同時能增加神經(jīng)沖動，減輕損傷周圍區(qū)的功能障礙，有利于腦室周圍白質損傷的修復[13]，對腦的可塑性有重要意義。

本實驗結果說明，早期干預和康復訓練可以明顯改善腦損傷仔鼠的運動功能，并且能夠減少MAG的表達。MAG蛋白的測定不但能夠為臨床早期診斷腦損傷提供重要的客觀依據(jù)，而且能為臨床確定最佳的檢查時間窗提供必要的依據(jù)。這也正是研究MAG在腦損傷中表達變化的意義所在[14]。

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