黃泉智，許成勇，孫志高，楊陽，胡亞卓，陳利平，王發(fā)渭

抑郁癥是一種以持續(xù)情緒低落、興趣或愉快感喪失為主要癥狀的情感障礙性疾病[1]。世界衛(wèi)生組織預測，到2020年抑郁障礙將成為發(fā)展中國家最嚴重的疾病負擔，人類死亡、殘疾的第2大原因，女性死亡和殘疾的首位疾病[2]。有研究顯示，慢性應激增加海馬神經(jīng)元凋亡，引起海馬結構和功能的變化，參與抑郁癥的發(fā)病[3]。本實驗通過觀察抑郁模型大鼠海馬區(qū)凋亡調控蛋白Bcl-2和Bax表達的變化，探索舒郁寧心湯抗抑郁功效的可能機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠70只，體重(200±20)g，解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證編號：SLXK京2009-0007。

1.1.2 藥物 鹽酸氟西汀分散片：PATHEON FRANCE公司(批號：9711B)，20 mg/粒，蒸餾水配成濃度為0.4 mg/ml的混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。舒郁寧心湯由柴胡、郁金、梔子、茯神、酸棗仁組成，解放軍總醫(yī)院中藥房鑒定提供，上藥浸泡、煎煮、過濾，于80℃恒溫水浴中濃縮至含生藥量5 g/ml藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑及設備 Bcl-2多克隆抗體(批號：990785W)和Bax多克隆抗體(批號：909901W)：北京博奧森生物技術有限公司產(chǎn)品；二抗顯色試劑盒：EnVision Detection Kit基因科技(上海)有限公司產(chǎn)品(Code No.GK500705)；全自動真空脫水機(LEICA ASP300)、組織包埋機(LEICA EG1140H)、石蠟切片機(LEICA RM2135)、展片機(LEICA HI1210)：德國LEICA公司；光學顯微鏡：日本OLYMPUS BX60系統(tǒng)顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及模型建立 動物飼喂于解放軍總醫(yī)院實驗動物中心SPF級嚙齒類動物實驗室，溫度20℃~24℃，噪聲≤60 dB，晝夜節(jié)律12/12 h。大鼠自由攝食和飲水，適應性飼養(yǎng)7 d后行曠場(open-field)試驗進行行為學評分，選擇得分相近的60只隨機分為6組：對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、鹽酸氟西汀組，每組10只。造模方法采用孤養(yǎng)加慢性輕度不可預見性的應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型[4]并稍加改進：對照組每籠飼養(yǎng)5只，正常飲食、飲水，不予任何刺激；其余各組每籠飼養(yǎng)1只，并接受21 d慢性應激刺激，包括禁水24 h、禁食24 h、夾尾1 min、電擊足底(20 V,1 s/次,間隔1 min,共20次)、冰水游泳(4℃,4 min)、傾斜籠子(45°,12 h)、轉換晝夜節(jié)律24 h、制動2 h、熱刺激40℃，5 min。每天隨機安排1種刺激，每種刺激重復2~3次。

1.2.2 給藥方法 低、中、高劑量組和鹽酸氟西汀組分別按正常成人(60 kg體重)與大鼠(200 g體重)體表面積折算。對照組不灌藥，模型組每日灌胃2 ml生理鹽水，低劑量組每日灌胃含生藥0.5 g舒郁寧心中藥2 ml，中劑量組每日灌胃含生藥1.5 g舒郁寧心中藥2 ml，高劑量組每日灌胃含生藥5.0 g舒郁寧心中藥2 ml，鹽酸氟西汀組每日灌胃含鹽酸氟西汀0.4 mg/ml混懸液2 ml。造模成功后于第22天起連續(xù)給藥3周。

1.2.3 曠場試驗 曠場裝置由不透明材料制成，底面為75×75 cm的正方形并被等分為25個正方形格，周壁高45 cm。將大鼠置于中心方格內，觀察大鼠在3 min內穿越格數(shù)(3爪均進入的方格方可記數(shù)，為水平運動得分)、后肢直立次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運動得分)。每只大鼠進行1次測定，每次3 min。由2位觀察者打分，取均值。分別于第0、21、42天測定。曠場試驗的水平運動減少反映動物的活動度降低；垂直運動減少反映動物對新鮮環(huán)境的好奇程度降低，探索行為減少。

1.2.4 免疫組化 曠場試驗結束后，所有大鼠10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，暴露心臟，以生理鹽水(37℃)約250 ml經(jīng)升主動脈灌注沖洗后，灌注4%多聚甲醛溶液(4℃,pH=7.4)200 ml，直至動物四肢僵硬。斷頭取腦，腦組織置于10%福爾馬林溶液中固定24 h，參照大鼠腦立體定位圖譜[5]對大鼠海馬組織取材，常規(guī)脫水，浸蠟包埋，置于APES防脫玻片上(片厚4 μm)。60°烤片4 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，0.01 mol/L PBS(pH=7.2~7.4)浸洗2 min，共3次；3%H2O210 min，PBS浸洗2 min，共3次；浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)。微波熱修復后，滴加一抗 Bcl-2(1∶150)、Bax(1∶300)，陰性對照組加0.01 mol/L PBS代替一抗，4℃冰箱孵育過夜，室溫復溫30 min后PBS浸洗5 min，共3次后滴加非生物素二抗，濕盒中室溫30 min，PBS浸洗5 min，共3次，DAB顯色光鏡下控制時間，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察，攝片。

1.2.5 圖像分析 采用Image Pro plus 5.1圖像分析系統(tǒng)測定每張照片的平均光密度值(AOD)，每張切片同一部位取5個不同的視野，所得數(shù)據(jù)以(±s)表示。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有計量數(shù)據(jù)以(±s)表示，進行正態(tài)性檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗法。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 曠場試驗 造模后，模型組水平運動得分、垂直運動得分均明顯低于對照組(P<0.01)，與其他組比較無顯著性差異(P>0.05)。給藥后，模型組水平運動得分、垂直運動得分明顯低于對照組(P<0.01)，高、中、低劑量組和鹽酸氟西汀組均明顯高于模型組(P<0.01)。見表1。

2.2 Bax和Bcl-2免疫組化 Bax蛋白陽性表達為黃色或棕黃色染色，染色深淺不一，主要位于細胞質中，胞核不染色。模型組表達明顯強于對照組(P<0.01)，高、中劑量組和鹽酸氟西汀組與模型組比較陽性表達降低(P<0.05)。見表2。

Bcl-2蛋白陽性表達為染色深淺不一的黃色或棕黃色染色，主要在細胞質中表達，胞核不染色。Bcl-2在模型組中陽性表達最弱，而在對照組中表達最強，高、中劑量組和鹽酸氟西汀組表達均較模型組增強(P<0.05)。見表2。

表1 曠場行為學測定比較

表2 各組大鼠海馬組織中Bax和Bcl-2陽性表達平均光密度值

3 討論

慢性輕度不可預見性的應激抑郁模型主要模擬了人類抑郁的快感缺乏、運動能力及社會交往能力下降、探索行為能力下降、侵犯攻擊能力缺陷、性行為能力下降等癥狀，是國際上公認的抑郁癥模型，文獻報道，慢性應激引起的抑郁狀態(tài)及行為異?？杀３謹?shù)月[6]。

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與情緒、學習和記憶、行為、免疫等的調節(jié)，它的損傷在各種應激所致疾患中起到關鍵作用[7]。慢性應激增加海馬神經(jīng)元細胞凋亡，引起海馬結構和功能的變化，參與抑郁癥的發(fā)病[3]。

本研究結果顯示，造模成功后經(jīng)過氟西汀和舒郁寧心中藥干預，大鼠海馬區(qū)凋亡調控蛋白Bcl-2和Bax表達發(fā)生了變化，提示舒郁寧心湯可能是通過調節(jié)大鼠海馬區(qū)凋亡調控蛋白Bcl-2和Bax來對抗海馬神經(jīng)元細胞凋亡，從而發(fā)揮抗抑郁的作用。

[1]沈漁邨.精神病學[M].5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:426-429.

[2]Duman RS,Kehne JH.Depression[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2007,6(3):161-162.

[3]謝守付,馬慧,劉偉,等.抑郁癥模型鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的初步研究[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2004,30(5):342-345.

[4]Winner P,Towell A,Sampson D,et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress,and its restoration by a tricyclic antidepressant[J].Psychopharmacology,1987,93:358-364.

[5]諸葛啟釧,譯.大鼠腦立體定位圖譜[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:43-51.

[6]De Vry J,Schreiber R.The chronic mild stress depression model:future developments from a drug discovery perspectivel[J].Psychopharmacology,1997,134:349-350.

[7]董愛國,趙麗麗,李海紅.BDNF在抑郁癥發(fā)病機制中的作用及其抗抑郁作用機制的研究進展[J].中國醫(yī)療前沿,2011,6(6):16-18.