代 蓉，董柳慧，石安華，淤澤溥

(云南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500)

近年來，雖然抗感染治療和器官功能支持技術(shù)取得了長足的進步，但嚴重感染的病死率仍高達30% ～50%［1-2］。臨床流行病學(xué)資料顯示，感染性休克是危重病患者的主要死亡原因之一，現(xiàn)已成為進一步提高危重癥救治成功率的最大障礙［3］。針對嚴重感染和感染性休克的發(fā)生率和病死率均居高不下，提高對該癥的認識、探索有效的治療方法和藥物，無疑具有重要的理論價值及臨床意義。

四逆湯是《傷寒論》中回陽救逆的著名方劑，厥陰病之表熱里寒、下利、大汗、手足厥冷等，均可使用四逆湯治療［4-5］。多項臨床及藥理研究亦表明，四逆湯對多種休克具有一定的治療作用，但以往開展的與其作用機制相關(guān)的藥理研究主要集中于強心和改善微循環(huán)等方面展開，尚不能很好解釋其回陽救逆功效的科學(xué)內(nèi)涵。

近年來的研究認為HPA軸作為膿毒癥時神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)重要的調(diào)控途徑，休克時HPA軸的負反饋調(diào)節(jié)機制受損，可導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂，表現(xiàn)為相對性腎上腺皮質(zhì)功能不全 (RAI)，調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)的功能狀態(tài)可能是感染性休克治療的新途徑。本研究從復(fù)制HPA軸抑制動物模型入手，在HPA軸抑制動物模型復(fù)制成功的基礎(chǔ)上，再注射內(nèi)毒素，進一步復(fù)制成HPA軸抑制大鼠感染性休克模型。探討四逆湯對該模型HPA軸的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，清潔級，體質(zhì)量 (250±20)g，雄性。購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，動物合格證號:SCXK(川)2009-16。實驗前動物先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予標準普通飼料和充分的飲用水，均為自由進食、自由飲水。飼養(yǎng)于云南中醫(yī)學(xué)院實驗動物室。

1.2 藥品和試劑

四逆湯所用藥材炙甘草、干姜購于昆明市中醫(yī)院，附子購于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，地塞米松 (DEX)，天津金耀氨基酸有限公司，批號:0901132;皮質(zhì)酮，購于 INTERNATIONAL LABORATORY USA公司;批號349610;脂多糖 0111:B4，購于 sigma公司，批號:029K4022。

ACTH試劑盒，購于北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司，批號:20100225;CORT試劑盒，購于南京建成生物工程研究所，批號:EPE0576R。

1.3 實驗用藥的制備

采用《傷寒論》中四逆湯原始組方，按漢代劑量單位換算，四逆湯方為:炙甘草31.2g，干姜23.4g，附子15g。實驗用方藥的制備按文獻［6-9］所記載方法進行，藥液濃縮成稠浸膏分裝置于冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要儀器

酶標儀:Molecular Device Corporation型號為340PC;放免儀:自動放免儀，中國科大中佳公司;RM6280型多道生理信號采集處理系統(tǒng):成都儀器廠。

2 方法和結(jié)果

2.1 四逆湯對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠的影響

［10-11］方法，雄性清潔級SD大鼠80只，體質(zhì)量200～250g，隨機分為正常組、模型組、四逆湯高、低劑量組，每組20只。(1)正常組:每天1次皮下注射等體積橄欖油，連續(xù)14d;(2)四逆湯高、低劑量組:低劑量為人用量的等效劑量，即6.25g/kg;高劑量為人用量的6倍量，即37.5g/kg。每天1次灌胃四逆湯，直至實驗結(jié)束。第4天開始，在每天灌胃給藥的同時，同模型組方法造模;(3)模型組:按10mg/kg體質(zhì)量皮下注射皮質(zhì)酮 (Corticosterone，CORT)，每天1次，連續(xù)14d。各組動物自由攝食攝水。實驗第18天，各組大鼠水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，37℃水浴放置1h，3 000轉(zhuǎn)離心15min，取上清液，-40℃保存待測。造模后，隔天記錄各組大鼠體質(zhì)量;參照文獻方法［10-11］酶聯(lián)免疫法測定各組大鼠血清CORT含量、放射免疫法測定大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素 (AdrenoCorticoTropic Hormone，ACTH)含量;取各組大鼠腎上腺，計算腎上腺指數(shù) (腎上腺指數(shù)=左右腎上腺質(zhì)量之和mg/大鼠體質(zhì)量g);取各組大鼠腎上腺，做病理組織學(xué)觀察。實驗結(jié)果見表1、表2:

表1 四逆湯對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠CORT、ACTH含量的影響 (x±s，n=20)

由表1可知，模型組CORT、ACTH含量比正常組降低 (P＜0.05)，表明HPA軸抑制，CORT、ACTH分泌減少;與模型組相比，四逆湯高劑量組大鼠血清CORT、ACTH含量升高 (P＜0.05、P＜0.01)，四逆湯低劑量組大鼠血清CORT含量也顯著升高 (P＜0.01)，提示四逆湯能夠?qū)笻PA軸抑制狀態(tài)。

表2 四逆湯對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠腎上腺指數(shù)的影響 (x±s，n=20)

由表2可見，模型組與正常組腎上腺指數(shù)比較，腎上腺指數(shù)明顯減輕 (P＜0.01)，提示長時間外源性給予皮質(zhì)酮，能使腎上腺萎縮;四逆湯高劑量組與模型組腎上腺指數(shù)比較，腎上腺指數(shù)增加(P＜0.05)，提示四逆湯高劑量能減輕皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠腎上腺萎縮。

2.2 四逆湯對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠感染性休克模型的影響

參考文獻［10，12-13］，清潔級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量250～270g。隨機分為7組:即正常組、模型組、陽性組、四逆湯預(yù)防給藥高、低劑量組、四逆湯治療給藥高、低劑量組，每組10只。(1)正常組:每天1次皮下注射等體積橄欖油，連續(xù)14d;(2)四逆湯預(yù)防給藥高、低劑量組:高低劑量的設(shè)置同前，每天1次灌胃四逆湯，直至實驗結(jié)束。第4天開始，在每天灌胃給藥的同時，同模型組方法造模;(3)模型組、陽性組、四逆湯治療給藥高、低劑量組:按10mg/kg體質(zhì)量皮下注射皮質(zhì)酮，每天1次，連續(xù)14d。各組動物自由攝食攝水。實驗第18天，四逆湯預(yù)防給藥高、低劑量組動物灌胃四逆湯1次，2h后各組大鼠水合氯醛麻醉，動物仰位固定在手術(shù)臺上，分離左側(cè)頸總動脈，取一內(nèi)充0.3%肝素生理鹽水的聚乙烯導(dǎo)管，插入左頸總動脈，此動脈導(dǎo)管與壓力換能器相連。用RM6280C型多道生理記錄儀記錄動脈血壓。穩(wěn)定半小時，記錄基礎(chǔ)血壓，各組動物腹腔注射LPS(4mg/kg)。注射 LPS后，陽性組腹腔注射DEX(5mg/kg)1次，四逆湯治療組灌胃四逆湯1次 (1mL/100g)。記錄注射LPS后3h血壓。參考文獻［12-13］標準，若平均動脈壓下降幅度超過基礎(chǔ)血壓值的20%，且持續(xù)20min以上，可認為實驗性感染性休克模型成功建立。記錄注射LPS前基礎(chǔ)血壓，及注射LPS后3h血壓值。結(jié)果見表3。

表3 四逆湯對HPA軸抑制感染性休克模型大鼠平均動脈壓的影響 ±s，n=10)

表3 四逆湯對HPA軸抑制感染性休克模型大鼠平均動脈壓的影響 ±s，n=10)

注:與正常組比＊＊P＜0.01;與模型組比△△P＜0.01;與治療高劑量比#P＜0.05

92.10±17.53 67.65±15.22 26.87±4.88模型組 87.85±35.52 60.28±28.33 34.79±11.69＊＊DEX組 5mg/kg 93.10±16.79 71.15±11.34 22.99±9.60△△預(yù)防高劑量組 37.5g/kg 100.01±40.60 83.40±30.06 14.91±5.05△△預(yù)防低劑量組 6.25g/kg 76.50±18.36# 60.70±16.12 20.90±5.74△△治療高劑量組 37.5g/kg 105.23±32.23 92.54±26.80 11.71±1.31△△治療低劑量組 6.25g/kg 101.53±19.27 86.02±8.80 14.08±6.89 100正常組組別 劑量 給LPS前血壓/mmHg A給LPS后血壓/mmHg B血壓下降率/%(A-B)/A*△△

由表3可知，模型組動物注射LPS后，平均動脈壓下降率超過20%，且下降率高于正常組 (P＜0.01)，可認為感染性休克模型復(fù)制成功。四逆湯預(yù)防組及治療組平均動脈壓下降率均低于模型組(P＜0.01)，提示四逆湯對感染性休克大鼠有一定的保護作用。

2.3 病理組織學(xué)檢查

2.3.1 組織蠟塊制備及HE染色

前一實驗中留取的腎上腺標本取材后置于10%甲醛溶液中固定24h后取出，水沖洗30min，梯度酒精脫水，浸蠟3h，即制成蠟塊。切成4μm厚的切片烤干備用。將烤干備用的切片置于60℃烤箱烤熱后于100%二甲苯中脫蠟25min;梯度酒精和蒸餾水水化后蘇木精染色5～15min，溫水沖洗5min藍化，鹽酸酒精分化，伊紅復(fù)染5～20s;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.3.2 結(jié)果

各組大鼠腎上腺病理切片觀察，見圖1～圖8。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

以上實驗結(jié)果，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù) (x)±標準差 (s)表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)進行方差分析;計量資料不符合正態(tài)分布，則用秩和檢驗;計數(shù)資料數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，或者用Fisher精確概率法;等級資料用秩和檢驗。

3 討論

近年來對中藥四性的基礎(chǔ)研究表明，溫?zé)崴幱性鰪奌PA軸的作用。沈自尹院士在對腎本質(zhì)的研究中證實:腎陽虛的病理改變主要在下丘腦，溫補腎陽的藥物可直接作用于下丘腦，提高促CRH的表達水平，調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸的受抑狀態(tài)?；谒哪鏈髦尾“Y與感染性休克之間的相似之處及其在臨床上所表現(xiàn)出的抗休克作用，溫?zé)崴帉PA軸受抑制模型大鼠的腎上腺皮質(zhì)軸的異常變化具有良好的糾正作用和我們前期實驗結(jié)果，我們認為:四逆湯主要通過改善于感染性休克時受抑制的HPA軸功能而發(fā)揮抗休克作用。本研究通過復(fù)制了HPA軸抑制動物模型和HPA軸抑制大鼠感染性休克模型，考察四逆湯對該模型HPA軸的影響。

正常情況下，CORT分泌的增加是ACTH刺激的結(jié)果，在皮質(zhì)酮所致HPA軸抑制的狀態(tài)下，血中較高水平的皮質(zhì)酮可對ACTH的分泌產(chǎn)生負反饋抑制，導(dǎo)致 ACTH分泌減少，模型組 CORT、ACTH含量比正常組降低 (P＜0.05)，CORT、ACTH分泌減少，說明大鼠HPA軸抑制，皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型復(fù)制成功。給予高低劑量的四逆湯后，能夠?qū)笻PA軸的抑制狀態(tài)，高劑量組大鼠血清CORT、ACTH含量均升高，低劑量組大鼠血清CORT含量也顯著升高，ACTH雖也有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。四逆湯改善HPA軸抑制狀態(tài)的機理還有待進一步研究。

圖1、圖2正常組腎上腺，HE染色，10×40，被膜由薄層結(jié)締組織構(gòu)成，無皺縮。球狀帶細胞較小，錐形，細胞聚集成球團狀。束狀帶細胞較大，多邊形，胞質(zhì)內(nèi)含脂滴空泡。

圖3、圖4皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型組腎上腺，HE染色，10×40，被膜皺縮，球狀帶細胞、束狀帶細胞體積縮小、數(shù)目減少，胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡增多。

圖5 高劑量組腎上腺

圖5、圖6四逆湯預(yù)防給藥高劑量組對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型腎上腺的影響，HE染色，10×40，被膜皺縮、球狀帶細胞、束狀帶細胞體積縮小、數(shù)目減少、胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡增多的現(xiàn)象較模型組減輕。

圖7、圖8四逆湯預(yù)防給藥低劑量組對皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型腎上腺的影響，HE染色，10×40，被膜皺縮、球狀帶細胞、束狀帶細胞體積縮小、數(shù)目減少、胞質(zhì)內(nèi)脂滴空泡增多的現(xiàn)象較模型組減輕。

實驗中模型組腎上腺指數(shù)在皮質(zhì)酮造模之后降低，提示長時間給予外源性糖皮質(zhì)激素使腎上腺萎縮;文獻報道［10］皮質(zhì)酮應(yīng)用能誘導(dǎo)大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細胞的大量調(diào)亡，減少球狀帶細胞的增殖和遷移，束狀帶和網(wǎng)狀帶細胞體積變小，皮質(zhì)酮造成腎上腺皮質(zhì)萎縮可能與上述因素均有關(guān)系。四逆湯高劑量組與正常組腎上腺指數(shù)比較，減少不明顯，并明顯高于模型組，提示四逆湯高劑量能減輕皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠腎上腺萎縮。四逆湯低劑量組腎上腺指數(shù)也高于模型組，雖然統(tǒng)計學(xué)上差異無顯著性意義，但出表現(xiàn)出減輕腎上腺萎縮的趨勢。組織病理學(xué)結(jié)果 (圖1～圖8)也表明:四逆湯高、低劑量組能改善腎上腺被膜皺縮狀態(tài)，使球狀帶細胞、束狀帶細胞體積較模型組增大、數(shù)目增加。由上可見，四逆湯可從多方面干預(yù)皮質(zhì)酮對腎上腺皮質(zhì)的損害或抑制，表現(xiàn)出對抗皮質(zhì)酮所致的大鼠HPA軸抑制。

在皮質(zhì)酮致HPA軸抑制大鼠模型復(fù)制成功的基礎(chǔ)上，給動物腹腔注射LPS復(fù)制HPA軸抑制大鼠感染性休克模型，為全面了解四逆湯的作用，增加了四逆湯預(yù)防給藥組。結(jié)果，四逆湯預(yù)防組及治療組平均動脈壓下降率均少于模型組 (P＜0.01)，提示四逆湯對感染性休克大鼠有一定的保護作用。文獻研究報道，四逆湯能顯著改善內(nèi)毒素性休克大鼠的微循環(huán)、抑制平均動脈壓的降低［14］。四逆湯能改善血壓、保持心率、減輕內(nèi)毒素引起的血液濃縮、抑制中性粒細胞數(shù)增加的作用，并在不同程度上提高內(nèi)毒素處理動物的存活率［15］。結(jié)合文獻報道和本實驗結(jié)果，我們認為四逆湯治療感染性休克時，其作用靶點可能是在HPA軸。本實驗用藥是以炙甘草為君藥的四逆湯，炙甘草用量較大，可以作為外源性糖皮質(zhì)激素補充在感染性休克時HPA軸抑制所致的糖皮質(zhì)激素相對不足。

本研究結(jié)果表明:四逆湯在感染中毒性休克伴腎上腺皮質(zhì)功能不全時能糾正HPA軸的抑制狀態(tài)，維持大鼠在應(yīng)激狀態(tài)下器官功能、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而對調(diào)節(jié)危重癥應(yīng)激反應(yīng)和休克狀態(tài)起重要治療作用。

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