荊生龍，徐 彭，趙宏艷，何曉鵑，李 靜，孫舒玉，羅 丹，王敏智，肖 誠(chéng)，呂 誠(chéng)△

(1.江西中醫(yī)學(xué)院，南昌 330004;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院臨床所，北京 100700;4.中日友好醫(yī)院，北京 100029)

壯骨關(guān)節(jié)丸主要由狗脊、淫羊藿、獨(dú)活、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、桑寄生、雞血藤、熟地黃、木香、乳香、沒(méi)藥組成，功以補(bǔ)益肝腎，養(yǎng)血活血，舒筋活絡(luò)，理氣止痛為主，用于肝腎不足、血瘀氣滯、脈絡(luò)痹阻所致的骨性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損。自上市以來(lái)，臨床療效確切，得到市場(chǎng)認(rèn)可，但2001年11月19日，國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心首次通報(bào)了壯骨關(guān)節(jié)丸引起肝損害等不良反應(yīng)情況，通報(bào)后(2001年11月)至2008年5月27日，國(guó)家中心病例報(bào)告數(shù)據(jù)庫(kù)共收到相關(guān)病例報(bào)告158例，不良反應(yīng)表現(xiàn)主要為皮疹、瘙癢、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、胃痛、血壓升高、肝功能異常，其中表現(xiàn)為肝損害的47例占30.4%。來(lái)自13個(gè)省、自治區(qū)、直轄市的47例肝損害相關(guān)病例報(bào)告顯示，患者主要為骨性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰間盤(pán)突出、頸椎病、骨質(zhì)增生、腰肌勞損等老年退行性骨關(guān)節(jié)病變。雖然癥狀明確，但未深入調(diào)查患者病因病機(jī)，因此推測(cè)由于臨床試驗(yàn)中所選對(duì)象的局限性，不能完全反映藥物對(duì)于不同中醫(yī)證候人群的效應(yīng)。為了探究壯骨關(guān)節(jié)丸對(duì)于不同類型骨性關(guān)節(jié)炎的影響，本研究通過(guò)壯骨關(guān)節(jié)丸連續(xù)灌胃腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎及骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠4周后的臟器系數(shù)及血清中TBIL含量變化，評(píng)價(jià)其對(duì)大鼠不良反應(yīng)的具體證況，為后續(xù)上市藥物安全性再評(píng)價(jià)中藥物毒理與證型研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雌性SD大鼠72只，體重 160g～180g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK-(軍)2007-004)。

1.2 藥物

注射用青霉素鈉由華北制藥股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)X1007206)，壯骨關(guān)節(jié)丸由三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)1111020S)，均由本實(shí)驗(yàn)室人員粉碎后，實(shí)驗(yàn)前以蒸餾水配成所需濃度。

1.3 儀器

HITACHI7180型全自動(dòng)生化分析儀(日本Hitachi High-Tech Science SystemsCorporation)，AE240型電子分析天平(日本 METTLER公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、骨性關(guān)節(jié)炎組、腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎組3大組，每組24只。每組大鼠按照不同的給藥劑量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、治療量組、高倍量組3小組，每組8只。共分為骨性關(guān)節(jié)炎模型組、治療量組、高倍量組，腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎模型組、治療量組和高倍量組。

1.4.2 建立模型 手術(shù)切除雌性大鼠卵巢，可造成NIM網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)，從而反映臨床腎虛證的某些病理變化特征，因此被用作腎虛模型常用造模方法，其分為骨性關(guān)節(jié)炎模型組、治療量組、高倍量組;腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎模型組、治療量組、高倍量組。當(dāng)然也有其他方法，比如外源性糖皮質(zhì)激素刺激［1］、腺嘌呤喂養(yǎng)等。此次研究主要采取無(wú)菌狀態(tài)下切除雌鼠雙側(cè)卵巢的方法進(jìn)行腎虛模型的建立。將腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎組大鼠麻醉后腹位固定，剪去鼠毛暴露手術(shù)視野，以75%酒精及碘酊消毒切開(kāi)皮膚、背部肌肉和腹膜，用小鑷子分離脂肪團(tuán)便可見(jiàn)卵巢，先將卵巢下端輸卵管用手術(shù)線結(jié)扎，然后摘除卵巢，切口縫合后敷以消炎粉。其他組全部大鼠手術(shù)入路同上，發(fā)現(xiàn)卵巢后僅切除與卵巢等量的脂肪后縫合皮膚。

腎虛模型建立 4周后，參考文獻(xiàn)方法［2～4］并加以調(diào)整，腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎組及骨性關(guān)節(jié)炎組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，在無(wú)菌狀態(tài)下切斷右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)部分半月板，制成骨性關(guān)節(jié)炎模型，縫合皮膚后連續(xù)3d腹腔注射4萬(wàn)單位PG0.2ml/只。正常組將右側(cè)膝關(guān)節(jié)部位皮膚切開(kāi)，然后縫合進(jìn)行假手術(shù)處理。

1.4.3 給藥劑量及方法 骨性關(guān)節(jié)炎模型建立后第2天，各組大鼠按照如下方式給藥:所有高倍量組給予壯骨關(guān)節(jié)丸5.55g/(kg·d)(成人等效劑量的5倍)灌胃;治療量組按照壯骨關(guān)節(jié)丸1.11g/(kg·d)劑量(成人等效劑量)灌胃;模型組及對(duì)照組大鼠則給予同等體積的蒸餾水灌胃。所有給藥，持續(xù)4周，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物正常供給飼料和飲水。

1.4.4 取材 給藥結(jié)束后，麻醉處死大鼠，立即取臟器心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺，稱濕重計(jì)算臟器系數(shù)并收集血清進(jìn)行TBIL含量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物臟器系數(shù)

表1顯示，各組動(dòng)物給藥4周后大鼠臟器系數(shù)(臟器重量/體重)變化情況:胸腺指數(shù)與正常對(duì)照組比較，正常治療量組及高倍量組卻顯著降低(P＜0.05)，而腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎模型組顯著偏高(P＜0.05)，即藥物對(duì)于正常大鼠可能具有一定影響，而對(duì)于病理狀態(tài)下的大鼠胸腺無(wú)明顯影響;肝臟指數(shù)與正常對(duì)照組相比較，正常高倍量組顯著增加(P＜0.05)，而腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎模型組卻顯著降低(P＜0.05);腎臟指數(shù)與正常對(duì)照組相比較，腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎模型組和治療量組顯著降低(P＜0.01)，而骨性關(guān)節(jié)炎模型組卻顯著偏高(P＜0.01);腎上腺指數(shù)與正常對(duì)照組相比較，僅正常高倍量組顯著偏高(P＜0.05)，其他組別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。心臟、脾臟以及肺臟指數(shù)與正常對(duì)照組相比，均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

2.2 總膽紅素檢測(cè)結(jié)果

血液生化指標(biāo)也為藥物毒性評(píng)價(jià)提供依據(jù)［5］，血清中的膽紅素大部分來(lái)源于衰老紅細(xì)胞被破壞后產(chǎn)生出來(lái)的血紅蛋白衍化而成，在肝內(nèi)經(jīng)過(guò)葡萄糖醛酸化的叫做直接膽紅素，未在肝內(nèi)經(jīng)過(guò)葡萄糖醛酸化的叫做間接膽紅素，二者之和就是總膽紅素，是膽色素的1種，肝細(xì)胞具有攝取、結(jié)合、排泄膽紅素的功能。血清膽紅素?cái)?shù)值的高低可以反映出肝臟病變或膽管阻塞等異常信息。報(bào)道顯示［6］，急性肝炎中血清TBIL濃度水平異常，因此其在實(shí)際臨床肝病檢測(cè)中意義重大。

圖1顯示，大鼠血清總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，正常高倍量組和OA高倍量組具有顯著差異。

表1 不同骨性關(guān)節(jié)炎大鼠灌胃壯骨關(guān)節(jié)丸后臟器系數(shù)結(jié)果(±s)

表1 不同骨性關(guān)節(jié)炎大鼠灌胃壯骨關(guān)節(jié)丸后臟器系數(shù)結(jié)果(±s)

注:各給藥組及模型組指標(biāo)數(shù)值分別與正常對(duì)照組比較:*P＜0.05，△P＜0.01

組別胸腺 心 肝 脾 肺 腎 腎上腺正常對(duì)照組1.86 ×10 －3±5.13 ×10 －4 3.74×10－3±2.54×10－4 3.39×10－2±2.16×10－3 2.04 ×10 －3±2.75 ×10 －4 6.78×10－3±1.06×10－3 6.53×10－3±4.08×10－4 2.27×10－4±4.40 ×10－5正常治療量組正常高倍量組OA模型組OA治療量組OA高倍量組腎虛型OA模型組腎虛型OA治療量組1.39 ×10 －3±2.78 ×10 －4*1.45 ×10 －3±4.91 ×10 －4*1.67 ×10 －3±3.26 ×10 －4 1.99 ×10 －3±2.62 ×10 －4 1.69 ×10 －3±2.59 ×10 －4 2.42 ×10 －3±4.97 ×10 －4*1.90 ×10 －3±3.99 ×10 －4 3.59×10－3±2.92×10－4 3.67×10－3±1.82×10－4 3.81×10－3±3.47×10－4 3.93×10－3±3.02×10－4 3.64×10－3±3.46×10－4 3.13×10－3±3.98×10－4 3.59×10－3±3.50×10－4 3.38×10－2±2.13×10－3 3.66×10－2±2.99×10－3*3.28×10－2±2.81×10－3 3.61×10－2±3.52×10－3 3.47×10－2±2.47×10－3 3.04×10－2±2.17×10－3*3.33×10－2±2.28×10－3 1.99 ×10 －3±4.58 ×10 －4 2.01 ×10 －3±2.58 ×10 －4 1.83 ×10 －3±2.58 ×10 －4 2.12 ×10 －3±1.96 ×10 －4 1.97 ×10 －3±3.16 ×10 －4 2.08 ×10 －3±5.67 ×10 －4 2.22 ×10 －3±3.61 ×10 －4 6.39×10－3±9.37×10－4 6.73×10－3±1.45×10－3 5.95×10－3±7.24×10－4 8.05×10－3±2.46×10－3 6.66×10－3±8.39×10－3 6.34×10－3±5.02×10－4 5.55×10－3±7.29×10－4 6.71×10－3±3.07×10－4 6.72×10－3±4.80×10－4 7.19×10－3±5.56×10－4 6.65×10－3±2.91×10－4 6.65×10－3±5.39×10－4 5.70×10－3±5.66×10－4 5.84×10－3±4.50×10－4 2.55×10－4±6.23 ×10 －5 2.84×10－4±6.84 ×10 －5*2.41×10－4±4.28 ×10 －5 2.32×10－4±3.55 ×10 －5 2.38×10－4±2.93 ×10 －5 1.84×10－4±2.95 ×10 －5 1.90×10－4±4.03 ×10 －5腎虛型OA高倍量組1.81 ×10 －3±2.68 ×10 －4 3.51×10－3±3.58×10－4 3.21×10－2±2.84×10－3 2.06 ×10 －3±1.98 ×10 －4 6.43×10－3±1.94×10－3 6.07×10－3±4.26×10－4 2.28×10－4±4.10 ×10－5

圖1 不同骨性關(guān)節(jié)炎大鼠灌胃壯骨關(guān)節(jié)丸后血清TBIL結(jié)果(μmol/L)

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)常被稱為退行性關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)增生、骨關(guān)節(jié)病，其主要病變是關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生，是中老年人群多發(fā)的風(fēng)濕性疾病，而其中又以女性更為常見(jiàn)，具體受累關(guān)節(jié)多發(fā)于負(fù)重較大的膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱以及手指關(guān)節(jié)等。中醫(yī)認(rèn)為，骨性關(guān)節(jié)炎首先是由于肝腎虧損，肝虛則血不養(yǎng)筋，筋不能維持骨節(jié)之張弛，關(guān)節(jié)失滑利，腎虛而髓減，致使筋骨失其所養(yǎng);其次過(guò)度勞累，日積月累，筋骨受損，營(yíng)衛(wèi)失調(diào)，氣血受阻，經(jīng)脈凝滯，筋骨失養(yǎng)，致生本病，故肝腎虧虛和慢性勞損是本病發(fā)病基礎(chǔ)［7］。

壯骨關(guān)節(jié)丸是治療退行性骨關(guān)節(jié)病的常用口服中藥復(fù)方制劑。據(jù)現(xiàn)代中藥藥理學(xué)毒理研究提示，該方劑12味中藥中至少已發(fā)現(xiàn)2種成分可造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠和豚鼠)的肝損害，如獨(dú)活含有佛手柑內(nèi)酯、歐芹酚甲醚、歐芹屬乙素、異補(bǔ)骨脂素和花椒毒素等，可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝毒損害。另1味中藥淫羊藿給藥3d，小鼠即出現(xiàn)嘔吐、納少、活動(dòng)減少，給藥15d處死，可見(jiàn)肝臟脂肪變性［8～10］。臨床報(bào)道也是在肝損害方面最為突出，而且患者以老年人為主要人群。當(dāng)然，單一成分的藥理研究結(jié)果不能等同于方劑的作用，對(duì)于其引起肝損害不良反應(yīng)的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

病證結(jié)合動(dòng)物模型既有西醫(yī)疾病的特點(diǎn)，又有中醫(yī)證候特征，它將有助于中藥藥理學(xué)研究和中藥藥效的評(píng)價(jià)，有利于更全面、客觀地認(rèn)識(shí)中藥的科學(xué)內(nèi)涵，對(duì)于探討中藥毒性與中醫(yī)證候特征之間的關(guān)系，更是顯示出較大的優(yōu)勢(shì)。由于中醫(yī)存在著同病異治和異病同治的理論，岳美中指出“病者本也，體也;證者標(biāo)也，象也;有病始有證，辨證方能識(shí)病，識(shí)病后可以施治”，因此臨床中藥使用過(guò)程中必須依據(jù)患者病因病機(jī)朔本求源、辨證施治，否則可能會(huì)因?yàn)樗幬飸?yīng)用不當(dāng)而產(chǎn)生不良影響。本研究所采用的動(dòng)物模型為病證結(jié)合模型，一定程度上能反映疾病的證候?qū)傩?，減少了中醫(yī)臨床的隨意性，使得中醫(yī)臨床辨病施治和辨證施治有證可循，這也將成為中醫(yī)理論與現(xiàn)代科技結(jié)合的一個(gè)突破口，為中藥臨床研究提供了廣闊的前景，所以采用對(duì)應(yīng)病證結(jié)合動(dòng)物模型評(píng)價(jià)中藥藥效和毒性更具有說(shuō)服力。

臟器系數(shù)在藥物的毒性反應(yīng)中，作為1項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)，可為藥物的評(píng)價(jià)提供參考。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，臟器系數(shù)與正常對(duì)照組相比正常高倍量組胸腺、肝及腎上腺具有顯著變化，而腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎模型組胸腺、肝、腎變化明顯，給藥后卻無(wú)顯著差異，提示本藥口服不會(huì)影響腎虛型骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的飲食、體重及各主要器官的生長(zhǎng)發(fā)育及組織形態(tài)，對(duì)這些方面無(wú)明顯毒副作用。但是對(duì)于正常大鼠影響較大，且血清中 TBIL的含量對(duì)比說(shuō)明，高倍量藥物對(duì)于正常及骨性關(guān)節(jié)炎大鼠肝臟影響較為顯著，由此說(shuō)明對(duì)證施藥在臨床中的重要性。

《內(nèi)經(jīng)》云:“……有故無(wú)殞，亦無(wú)殞也?！敝嗅t(yī)傳統(tǒng)理論強(qiáng)調(diào)中藥藥性毒性和“證”的密切關(guān)系，而目前中藥毒理學(xué)研究采用正常動(dòng)物研究中藥毒性的方法恰恰忽略了這些方面。所謂“有病則病受之”，反之無(wú)病則體受之［11，12］。在沒(méi)有病邪存在的情況下，中藥的藥性作用于正常機(jī)體就表現(xiàn)為毒性。而當(dāng)我們采用證候動(dòng)物模型時(shí)，其藥性作用于病邪，可能表現(xiàn)的就是治療作用，后者才能準(zhǔn)確反映中藥應(yīng)用于臨床的情況。但這種研究方法目前存在的最大問(wèn)題，就在于中醫(yī)證候動(dòng)物模型的建設(shè)尚未形成一個(gè)完善的體系。有毒中藥對(duì)不同狀態(tài)、不同層次證候模型所產(chǎn)生的藥物效應(yīng)是有差異的，在評(píng)價(jià)中通過(guò)比較這些差異，可以為深入揭示其毒-效關(guān)系和發(fā)生機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)［13］。因此，通過(guò)加強(qiáng)證候動(dòng)物模型的建設(shè)來(lái)促進(jìn)中藥毒理學(xué)研究是必要的。

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