王 瑩，王少君，潘靜華，劉 紅，李 艷，付小衛(wèi)，汪文來，周晟芳，李亞楠，趙紅霞，于 崢，趙宏艷，張治國，劉梅潔，Gary Guishan Xiao，鞠大宏△

(1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;2.浙江中醫(yī)藥大學，杭州 310053;3.Osteoporosis Research Center，Creighton University，USA)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，POMP)屬中醫(yī)“痹證”、“骨痿”等范疇。中醫(yī)認為，“腎虛”是導致該病發(fā)生的主要原因，臨證應(yīng)以“補腎”為基本大法;而巴戟天具有補腎壯陽之功效，基于此我們以卵巢切除所致的骨質(zhì)疏松癥大鼠為模型，探討巴戟天對其的治療作用，并初步探討其機理，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用雌性清潔級Wistar大鼠60只，體重250g±20g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供(許可證號 SCXK-(軍)2002-001)。大鼠飼養(yǎng)和實驗均在中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級實驗動物室內(nèi)進行(實驗動物室許可證號SYXK(京)-2005-0024)。

1.1.2 藥物 巴戟天:購自廣東省藥材公司中藥飲片廠，經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所生藥室鑒定，為茜草科 (Rubiaceae)茜草屬巴戟天 Morinda officinalis How的干燥根。加水煎煮，藥液濃縮至1g生藥/ml的濃度。

1.1.3 主要試劑 大鼠OPG、RANKL免疫組化一抗:美國Santa cruze;二抗二步法免疫組化檢測試劑:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DAB顯色試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;鹽酸四環(huán)素:欣惠澤奧科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 Reicheit-Jung2040切片機:德國;OM2563冰凍切片機:美國TBS公司;Qwin圖像分析儀系統(tǒng):德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 先將60只雌性Wistar大鼠隨機分為3組:空白對照組12只，假手術(shù)組12只和造模組36只。造模組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，摘除雙側(cè)卵巢［1］;假手術(shù)組只摘取卵巢周圍少許脂肪組織。術(shù)后1個月，再將造模組大鼠隨機分為3組:模型組12只，陽性對照組12只，巴戟天組12只，然后開始給藥。巴戟天組灌胃給予濃度為1g生藥/ml的水煎劑，陽性對照組灌胃給予0.008mg/ml的己烯雌酚，給藥體積均為5.6ml/kg體重。以上灌胃給藥3個月，每天1次，連續(xù)6d，休息1d，再連續(xù)給藥6d?？瞻讓φ战M、假手術(shù)組、模型組按上法灌服等體積的蒸餾水。大鼠處死前15d和前3d腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，以對骨進行熒光標記。給藥結(jié)束后，將各組大鼠迅速脫頸椎處死。取右側(cè)脛骨，用4%多聚甲醛溶液固定，制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計量學檢測;取左側(cè)脛骨用0.01M PBS(PH7.3)配制的4%多聚甲醛溶液固定，制作脫鈣的冰凍切片，用于OPG、RANKL蛋白表達的檢測。

1.2.2 指標的檢測方法 (1)骨組織形態(tài)計量學指標的測定:取右側(cè)脛骨近端1/3，除凈周圍附著的軟組織，采用塑料包埋方法，制作不脫鈣骨切片;其中一張切片進行甲苯胺藍染色，另一張切片則直接用于熒光觀察。采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)，按章明放等人的方法對不脫鈣骨切片進行形態(tài)計量［2］。骨小梁組織形態(tài)計量:骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比，是衡量骨量水平的主要標志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷OC的活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細胞(OB)被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷OB的活性;骨小梁礦化率(MAR):骨小梁表面熒光雙標記帶的平均距離除以2次標記相隔的天數(shù)。皮質(zhì)內(nèi)表面形態(tài)計量:類骨質(zhì)平均寬度(OSW):皮質(zhì)內(nèi)表面有OB被覆的類骨質(zhì)的平均寬度;骨皮質(zhì)礦化率(mAR):皮質(zhì)內(nèi)表面雙標記帶的平均距離除以2次標記相隔的天數(shù);(2)OB和骨髓基質(zhì)細胞(MSC)OPG、RANKL蛋白表達的檢測:取左側(cè)脛骨近端1/3，按照文獻［3］的方法進行標本處理，采用免疫組化法檢測OB和MSC OPG、RANKL的蛋白表達。采用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)，參照文獻［4］方法進行計量。

2 結(jié)果

2.1 巴戟天對去卵巢大鼠脛骨骨組織形態(tài)計量學指標的影響

2.1.1 巴戟天對去卵巢大鼠脛骨TBV%的影響 表1顯示，模型組大鼠脛骨TBV%較假手術(shù)組明顯降低。巴戟天組TBV%顯著高于模型組，但低于假手術(shù)組;陽性對照組的TBV%顯著高于模型組，而與假手術(shù)組比較無顯著性差異。

表1 各組大鼠脛骨TBV%的變化

2.1.2 巴戟天對去卵巢大鼠脛骨TRS%的影響 表2顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脛骨TRS%顯著升高。巴戟天組的TRS%顯著低于模型組，而高于假手術(shù)組;陽性對照組的TRS%顯著低于模型組，而與假手術(shù)組比較無顯著性差異。

2.1.3 巴戟天對去卵巢大鼠脛骨TFS%和MAR的影響 表3顯示，模型組大鼠脛骨 TFS%、MAR顯著高于假手術(shù)組。與模型組相比，巴戟天組的TFS%、MAR顯著降低，而與假手術(shù)組相比明顯增高;陽性對照組的TFS%、MAR顯著低于模型組，而與假手術(shù)組比較無顯著性差異。

表2 各組大鼠脛骨TRS%的變化

2.1.4 巴戟天對去卵巢大鼠脛骨mAR和OSW的影響 表4顯示，模型組大鼠脛骨 mAR和OSW皆明顯高于假手術(shù)組。巴戟天組的 OSW、mAR與模型組比較均無顯著性差異;陽性對照組mAR和OSW與模型組比較顯著降低，與假手術(shù)組比較無顯著性差異。

表3 各組大鼠脛骨TFS%和MAR的變化

表4 各組大鼠脛骨mAR和OSW的變化

2.2 巴戟天對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC OPG和RANKL蛋白表達的影響

2.2.1 巴戟天對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達的影響 表5顯示，模型組大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達陽性密度均明顯低于假手術(shù)組。巴戟天組的陽性密度明顯低于假手術(shù)組，而與模型組比較無顯著性差異;陽性對照組的陽性密度明顯高于模型組，而與假手術(shù)組比較無顯著性差異。

表5 各組大鼠脛骨OB和MSC OPG蛋白表達的變化

2.2.2 巴戟天對去卵巢大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達的影響 表6顯示，模型組大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達陽性密度明顯高于假手術(shù)組。與模型組相比，巴戟天組 OB和 MSC RANKL的陽性密度均明顯降低;而與假手術(shù)相比，MSC RANKL的陽性密度明顯升高，OB RANKL的陽性密度無顯著性差異;陽性對照組 OB和 MSC RANKL的陽性密度均明顯低于模型組，而與假手術(shù)組比較無顯著性差異。

表6 各組大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達的變化

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，切除大鼠卵巢后，模型組的骨量主要標志的TBV%顯著降低，而代表骨吸收參數(shù)的TRS%以及代表骨形成參數(shù)的TFS%、MAR、OSW和mAR均顯著增高，表明卵巢切除所造成的是一種骨吸收大于骨形成的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型，這與人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機理相似。給大鼠灌服3個月的巴戟天后，與模型組比較，巴戟天組的大鼠脛骨 TBV% 顯著增加，TRS%、TFS%和 MAR明顯降低，OSW和mAR則無顯著性差異。這一結(jié)果表明，巴戟天對卵巢切除所造成的高轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松癥具有一定的治療作用。

本實驗結(jié)果亦顯示，大鼠切除卵巢后，模型組大鼠脛骨OB、MSC OPG蛋白及其mRNA的表達顯著降低，而RANKL蛋白及其mRNA的表達均顯著增高。這一結(jié)果說明，雌激素缺乏時，OB和MSC OPG蛋白表達減少，RANKL蛋白表達增多，是導致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的機理之一。有研究發(fā)現(xiàn)，與使用雌激素替代療法的絕經(jīng)后女性相比，沒有使用雌激素替代療法的絕經(jīng)后女性的MSC、B淋巴細胞和T淋巴細胞的RANKL表達是前者的2～3倍;且其RANKL的表達與代表骨吸收的生物學標志物呈正相關(guān)，與血清雌二醇的水平呈負相關(guān)［5］。Bord等對人類 OB進行體外培養(yǎng)并給予生理劑量的雌激素，發(fā)現(xiàn)其OPG的蛋白表達在培養(yǎng)后24h和48h均顯著性增高［6］。Ulriki等發(fā)現(xiàn)，對絕經(jīng)后女性給予4個月的雌激素治療后，其成骨祖細胞的多種細胞周期蛋白表達降低，而鈣黏連蛋白表達升高，同時其外周血和骨髓基質(zhì)中的OPG水平也發(fā)生了改變［7］。在本實驗中，在給大鼠灌服3個月的巴戟天后，與模型組相比，巴戟天組大鼠脛骨OB和MSC RANKL蛋白表達均顯著下調(diào)，而OPG蛋白表達無顯著性變化。這一結(jié)果表明，巴戟天組的作用途徑是通過降低RANKL的表達，使 RANKL與RANK的結(jié)合減少，從而抑制破骨細胞的成熟與活性，減少骨的過度吸收，進而達到治療骨質(zhì)疏松癥的作用。

［1］鞠大宏，張春英，王安民，等.溫補腎陽方對去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠 IL-1和 IL-6活性的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2000，6(4):29-32.

［2］章明放，張乃鑫，譚郁彬.運動對雌性大鼠去勢后骨質(zhì)疏松癥的作用［J］.中華骨科雜志，1994，14(6):365-369.

［3］鞠大宏，于福祿，張麗坤，等.滋陰補腎法對卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠成骨細胞 COX-2蛋白和 mRNA表達的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2006，12(12):918-920.

［4］賈朝娟，鞠大宏，劉梅潔，等.山藥對卵巢切除大鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用及其機理探討［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2009，15(4):268-271.

［5］Eghbali-Fatourechi G，Khosla S，Sanyal A..Role of RANK ligand in mediating increased bone resorption in early postmenopausal women［J］.J Clin Invest，2003，111:1221-1230.

［6］Bord S，Ireland DC，Beavan SR，Compston JE.The effects of estrogen on osteoprotegerin， RANKL， and estrogen receptor expression in human osteoblasts［J］.Bone，2003，32:136-141.

［7］Ulrike I，Matthew M，KelleyHoey.Effectsofestrogen on osteoprogenitor cells and cytokines/bone-regulatory factors in postmenopausal women［J］.Bone，2011，49:202-207.