王光勇，狄國(guó)杰，曾 曉，劉苗苗，何毓敏，袁 丁，張長(zhǎng)城，王 婷△

(1.宜昌市夷陵區(qū)人民醫(yī)院，湖北 宜昌 443100;2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443000)

隨著世界人口老齡化程度日益加重，衰老也成為人們備受關(guān)注的科學(xué)前沿。研究表明，氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)是衰老的中心學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，正常情況下線粒體有氧呼吸不停地產(chǎn)生自由基副產(chǎn)品(如 O2－、H2O2、OH·等)，但同時(shí)機(jī)體又具有有效的自由基清除系統(tǒng)(如谷胱甘肽還原系統(tǒng)、超氧化物歧化酶等)，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡。隨著年齡的增長(zhǎng)，這種平衡逐漸被破壞，造成活性氧(ROS)開始堆積，過(guò)量的自由基可通過(guò)氧化作用攻擊細(xì)胞膜及核酸、蛋白質(zhì)和酶類等生物大分子，引起細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，核酸及蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，DNA突變或復(fù)制異常及生物酶活力下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能嚴(yán)重受損而致衰老［1］。

五子衍宗方是中醫(yī)補(bǔ)腎益精的傳統(tǒng)名方，由枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、車前子(鹽炒)組成，具有補(bǔ)腎益精之功效［2］。而中醫(yī)的腎虛衰老理論認(rèn)為，腎主藏精、生髓通于腦，與人體生長(zhǎng)發(fā)育衰老密切相關(guān)，補(bǔ)腎是延緩衰老、防治多種老年病的重要法則。現(xiàn)代藥理研究表明，五子衍宗方具有調(diào)節(jié)體內(nèi)性激素水平、改善生殖功能、增強(qiáng)免疫及抗氧自由基損傷等藥理作用［3～5］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)皮下連續(xù)注射D-半乳糖(D-Gal)建立小鼠衰老模型，研究五子衍宗方對(duì)衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶及抗氧化損傷的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，體重28g～32g，造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0005)。

1.2 藥品與試劑

五子衍宗方組成:枸杞子 400g，菟絲子(炒)400g，覆盆子 200g，五味子(蒸)50g，車前子(鹽炒)100g，購(gòu)于宜昌市本草堂大藥房。D-半乳糖購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

DT-200跳臺(tái)自動(dòng)測(cè)試儀，成都泰盟科技有限公司;MT-200 Morris水迷宮，成都泰盟科技有限公司;JA2003型電子分析天平，上海天平儀器廠;LDZ5-2型自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司;PK-600S型水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥

取雄性昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、五子衍宗方低劑量組、五子衍宗方高劑量組4組，每組10只。正常組頸背部皮下注射生理鹽水，其他各組均皮下注射D-半乳糖(150mg/kg/d)進(jìn)行造模，每天1次。五子衍宗方低、高劑量組分別灌服相應(yīng)劑量的水提取物 0.49g/kg/d、0.98g/kg/d(分別相當(dāng)于生藥1.23g/kg/d、2.46g/kg/d)，正常組和模型組灌胃給予等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥8周。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

造模后第7周開始測(cè)試。迷宮水池高50cm，直徑80cm，水池等分成東、西、南、北4個(gè)象限，在其中一象限處放一平臺(tái)，平臺(tái)低于水面1.5cm。每次將小鼠從同一點(diǎn)面向池壁放入水中，先進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)即空間學(xué)習(xí)訓(xùn)練，記錄每只動(dòng)物入水后找到平臺(tái)所需時(shí)間，即潛伏期，作為學(xué)習(xí)記憶成績(jī)。動(dòng)物爬上平臺(tái)后在上面逗留時(shí)間大于2s，就認(rèn)為找到平臺(tái);若120s內(nèi)未能找到平臺(tái)，成績(jī)按120s計(jì)，操作者引導(dǎo)動(dòng)物至平臺(tái)并使其在上面逗留2s，定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5d。第6天撤除平臺(tái)，選擇離原平臺(tái)最遠(yuǎn)的象限為動(dòng)物入水點(diǎn)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。記錄120s內(nèi)動(dòng)物在原平臺(tái)所在象限的時(shí)間和經(jīng)過(guò)原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)，將其作為評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在安靜的房間內(nèi)進(jìn)行，水溫控制在22℃ ±0.5℃。

2.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

將受試小鼠放入跳臺(tái)儀中，適應(yīng)環(huán)境3 min，然后通以36 V交流電。觀察小鼠第1次跳下跳臺(tái)的時(shí)間，即潛伏期以及5 min內(nèi)小鼠由高臺(tái)跳下受到電擊的次數(shù)，即錯(cuò)誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，記錄潛伏期和5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)，作為記憶成績(jī)。測(cè)試時(shí)若小鼠停留在平臺(tái)上超過(guò)5 min，其潛伏期以300 s計(jì)。

2.4 小鼠臟器指數(shù)的測(cè)定

處死小鼠后，迅速取出腦、胸腺和脾臟，經(jīng)生理鹽水洗凈后，用濾紙沾去臟器表面水分稱重，以臟器重量(mg)/體重(g)計(jì)算臟器指數(shù)。

2.5 小鼠血清中抗氧化酶的測(cè)定

小鼠眼球取血分離血清后，分別采用羥胺法和硫代巴比妥酸法檢測(cè)血清中SOD活力和MDA含量。測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)觀察各組間差異。

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮

表1顯示，在空間學(xué)習(xí)訓(xùn)練階段，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短，說(shuō)明小鼠獲得了一定的空間記憶能力，且模型組小鼠各天的潛伏期均比對(duì)照組延長(zhǎng)(P＜0.05或P＜0.01);五子衍宗方高劑量組在第5天的潛伏期比模型組縮短(P＜0.05)。圖1顯示，在空間探索實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠在平臺(tái)所在象限(第三象限)的時(shí)間比對(duì)照組短(P＜0.05)，各給藥組有延長(zhǎng)的趨勢(shì);與模型組相比，穿越平臺(tái)的次數(shù)各給藥組顯著升高(P＜0.05或 P＜0.01)，說(shuō)明五子衍宗方能改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

表1 Morris水迷宮中各組小鼠每天潛伏期(±s，，n=10)

表1 Morris水迷宮中各組小鼠每天潛伏期(±s，，n=10)

注:與對(duì)照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05

組別潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天77±17 68±16 66±16 60±17 65±18模 型 組 108±10##101±11#98±14##89±18# 90±10##五子衍宗方低劑量組 101±33 95±29 86±24 79±19 78±15五子衍宗方高劑量組 94±22 87±17 81±21 77±21 72±16對(duì)照組*

圖1 空間探索實(shí)驗(yàn)中各組小鼠停留在各象限的時(shí)間和通過(guò)平臺(tái)次數(shù)

3.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

表2顯示，模型組與對(duì)照組相比出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，跳臺(tái)過(guò)程中錯(cuò)誤次數(shù)增加，潛伏期縮短。與模型組相比，五子衍宗方對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用，可減少錯(cuò)誤次數(shù)，延長(zhǎng)潛伏期。

3.3 五子衍宗方對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的腦指數(shù)、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響

表3顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠的腦指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯下降(P＜0.05或 P＜0.01)，與模型組相比，五子衍宗方能增加腦指數(shù)和胸腺指數(shù)。結(jié)果表明五子衍宗方能拮抗D-半乳糖導(dǎo)致的小鼠臟器功能的衰退，提高機(jī)體免疫力。

表2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)(±s，n=10)

表2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)(±s，n=10)

注:與對(duì)照組比較:#P＜0.05，##P ＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別錯(cuò)誤次數(shù)對(duì)照組學(xué)習(xí)過(guò)程 記憶潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù) 潛伏期(s)37.9±13.9 2.6±1.1 214.2±67.5 0.9±0.6模 型 組 28.5±12.5 4.5±1.2## 127.6±36.1## 2.2±0.8##五子衍宗方低劑量組 34.1±9.0 3.6±1.2 147.6±44.6 1.9±0.6五子衍宗方高劑量組 36.3±12.3 3.0±1.2＊＊ 177.2±57.9＊＊ 1.4±0.5*

表3 各組小鼠腦指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的比較(±s，n=10)

表3 各組小鼠腦指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的比較(±s，n=10)

注:與對(duì)照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P ＜ 0.01

組別 腦指數(shù)(mg·g－1)脾臟指數(shù)(mg·g－1)胸腺指數(shù)(mg·g－1)11.9±0.5 3.8±0.9 2.2±0.5模 型 組 9.1±0.4## 4.3±0.6 1.8±0.3#五子衍宗方低劑量組 11.1±1.1＊＊ 4.4±0.5 2.1±0.3＊＊五子衍宗方高劑量組 11.5±0.4＊＊ 4.5±0.8 2.2±0.3對(duì)照組＊＊

3.4 五子衍宗方對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清中SOD活力和MDA含量的影響

如表4所示，與正常組相比，模型組小鼠血清中SOD活力明顯下降(P＜0.01)，MDA含量明顯增多(P＜0.01)，五子衍宗方各給藥組能提高衰老小鼠血清中SOD活力 (P＜0.05)，明顯降低衰老小鼠血清中MDA的含量(P＜0.01)。

表4 各組小鼠血清中SOD活力和MDA含量的比較(±s，n=10)

表4 各組小鼠血清中SOD活力和MDA含量的比較(±s，n=10)

注:與對(duì)照組比較:##P ＜0.01;與模型組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 SOD活力(U/ml)MDA(nmol/ml)101.0±19.5 8.0±1.0模 型 組 68.1±15.1## 10.6±1.1##五子衍宗方低劑量組 72.3±11.9* 7.9±0.7＊＊五子衍宗方高劑量組 83.9±13.2* 7.8±1.1對(duì)照組＊＊

4 討論

D-半乳糖衰老動(dòng)物模型造模方法簡(jiǎn)便易行、價(jià)格低廉、結(jié)果穩(wěn)定，已成為國(guó)內(nèi)公認(rèn)的衰老動(dòng)物模型，在抗衰老藥物研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)D-gal濃度升高時(shí)，會(huì)在醛糖還原酶催化作用下還原為半乳糖醇，半乳糖醇不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝，從而在細(xì)胞內(nèi)堆積，影響細(xì)胞正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能發(fā)生障礙和代謝紊亂造成機(jī)體衰老［6］。本研究結(jié)果表明，小鼠經(jīng)D-半乳糖連續(xù)注射8周后，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，抗氧化水平失衡以及腦和胸腺萎縮等病理生理改變。

中醫(yī)理論認(rèn)為，腎主智，腎虛則智不足，認(rèn)知障礙與腎虛髓空密切相關(guān)［7］。五子衍宗方是中醫(yī)補(bǔ)腎益精的傳統(tǒng)名方，臨床多用于治療男性不育癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，五子衍宗方能改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，表現(xiàn)為空間探索能力及記憶能力的增強(qiáng)。

脾臟是外周免疫器官，隨年齡的增長(zhǎng)會(huì)逐漸萎縮，導(dǎo)致免疫功能減退;胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官，對(duì)維持細(xì)胞免疫和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要作用。有研究表明，五子衍宗方對(duì)免疫低下小鼠的免疫功能有調(diào)節(jié)作用，對(duì)免疫受抑小鼠的特異性及非特異性免疫功能均有明顯促進(jìn)作用［8，9］。本實(shí)驗(yàn)也表明，五子衍宗方可明顯提高衰老小鼠胸腺指數(shù)，說(shuō)明五子衍宗方具有一定增強(qiáng)衰老模型小鼠免疫功能從而延緩衰老的作用。

研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的抗氧化防御能力逐漸降低，大量的自由基攻擊細(xì)胞膜及核酸、蛋白質(zhì)和酶類等生物大分子，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能嚴(yán)重受損而致衰老。SOD是體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶之一，主要存在于胞漿和線粒體中，SOD歧化超氧陰離子為H2O2，在過(guò)氧化氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為H2O和氧分子，從而減弱超氧陰離子的氧化損傷。MDA是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用的最終分解產(chǎn)物之一，其含量水平可間接反映了機(jī)體內(nèi)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度［10，11］。本實(shí)驗(yàn)中，D-半乳糖致衰老模型小鼠體內(nèi)的SOD活性顯著降低，MDA含量升高，五子衍宗方能增強(qiáng)小鼠血清中SOD活性，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，從而改善D-半乳糖所致的氧化損傷發(fā)揮抗衰老作用。

綜上所述，五子衍宗方能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)揮抗衰老作用。

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