李克 王進(jìn) 劉永林

5-羥色胺(5-Hydroxyptamine，5-HT)是一種吲哚衍生物，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織內(nèi)。5-羥色胺遞質(zhì)系統(tǒng)也比較集中，其神經(jīng)元主要位于低位腦干近中線區(qū)的中縫核內(nèi)。按其纖維投射途徑的不同，也可分為三部分:上行部分、下行部分和支配低位腦干部分。上行部分的神經(jīng)元位于中縫核上部，其神經(jīng)纖維投射到紋狀體、丘腦、下丘腦、邊緣前腦和大腦皮層。腦內(nèi)5-羥色胺主要來自中縫核上部，破壞中縫核上部可使腦內(nèi)5-羥色胺含量明顯降低。

伏核(nucleus accumbens，NAc)是錐體外系的重要組成部是把情緒動(dòng)機(jī)轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)界面，是邊緣運(yùn)動(dòng)的接口［1］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性Wistar大鼠 沈陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供，5-HT試劑盒(購于Sigma公司);LUZEX-F顯微圖像分析儀(日本，松下公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 本實(shí)驗(yàn)選用雄性健康Wistar大鼠40只，體重260～300 g，隨機(jī)分成兩組。正常對(duì)照組:20只。實(shí)驗(yàn)組:20只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 力竭游泳訓(xùn)練大鼠模型制備 大鼠在長1.5 m，寬0.8 m，高0.6 m，水深0.5 m，水溫(35±2)℃的游泳池內(nèi)進(jìn)行訓(xùn)練，時(shí)間為1周。力竭游泳訓(xùn)練的標(biāo)準(zhǔn)為:大鼠游泳動(dòng)作明顯失調(diào)，且沉入水中10 s不再浮起［2］。

1.3.2 組化標(biāo)本制備 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用1%戊巴比妥鈉(40 ml/Kg)腹腔麻醉后開胸，經(jīng)左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的生理鹽水500 ml，同時(shí)剪開右心耳。繼用0.1 m磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦組織，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中進(jìn)行后固定大約2 h，之后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經(jīng)水包埋，恒冷箱連續(xù)橫切片，片厚20 μm。經(jīng)OCT包埋，恒冷箱連續(xù)切片，片厚16 μm，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 尼氏染色 冰凍切片吹干，經(jīng)PBS漂洗5 min 3次，將切片置入1%甲苯胺藍(lán)溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5 min 3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3.4 5-HT染色方法 ①冰凍切片吹干，PBS沖洗5 min 3次。②1:50正常羊血清中孵育30 min。③傾去血清，加入兔抗5-HT抗體(1:4000)，4℃過夜。④PBS沖洗5 min 3次。⑤滴加生物素化抗兔抗體(二抗)1:40稀釋，室溫孵育60 min。⑥PBS沖洗5 min 3次。⑦滴加HRP標(biāo)記的卵白素1:40稀釋，室溫孵育60 min。⑧PBS沖洗5 min 3次。⑨DAB成色5 min。⑩PBS沖洗5 min 3次。[11]梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。[12]對(duì)照實(shí)驗(yàn)在鄰近切片上進(jìn)行，用抗原吸收后的一抗代替一抗，結(jié)果為陰性。

1.4 顯微圖像定量分析 用Luzex-F顯微圖像分析儀測定伏核內(nèi)單位面積5-HT陽性反應(yīng)物平均灰度值，所得數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)SAS軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 尼氏染色結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠伏核內(nèi)神經(jīng)原細(xì)胞的尼氏染色切片上，神經(jīng)元數(shù)量較多，排列緊密，形態(tài)完整，泡漿有內(nèi)尼氏體。

實(shí)驗(yàn)組伏核內(nèi)細(xì)胞，正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，細(xì)胞豐滿，泡漿內(nèi)尼氏體豐富。根據(jù)尼氏染色說明力竭訓(xùn)練大鼠模型制備成功。

2.2 5-HT染色結(jié)果 正常對(duì)照組可見5-HT陽性反應(yīng)物分布于大鼠伏核內(nèi)，分布于胞質(zhì)及突起，胞核不著色，細(xì)胞形態(tài)完整但細(xì)胞數(shù)量少，纖維豐富。與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組5-HT陽性反應(yīng)物大量增多(P＜0.01)可見大量陽性細(xì)胞及陽性纖維。見表1和圖1。

表1 力竭游泳訓(xùn)練后大鼠與正常大鼠伏核單位面積5-HT陽性物反應(yīng)物平均灰度值(±s)

表1 力竭游泳訓(xùn)練后大鼠與正常大鼠伏核單位面積5-HT陽性物反應(yīng)物平均灰度值(±s)

注:*與正常組比較P＜0.01

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圖1 力竭游泳訓(xùn)練后大鼠與正常大鼠伏核單位面積5-HT陽性物反應(yīng)物平均灰度值

3 討論

NAc是錐體外系的重要結(jié)構(gòu)，伏核參與腹側(cè)環(huán)路啟動(dòng)的運(yùn)動(dòng)，主要影響并參與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的情感和動(dòng)機(jī)反應(yīng)。

5-HT是分布與腦干中縫核簇內(nèi)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，它通過廣泛的纖維投射和多種受體的介導(dǎo)，參與多種機(jī)體的生理活動(dòng)［3］。過量的5-HT可能在中樞系統(tǒng)引起人體疲勞，在運(yùn)動(dòng)情況下，無論是間歇性運(yùn)動(dòng)或持續(xù)性運(yùn)動(dòng)，都會(huì)使游離色氨酸更容易進(jìn)入腦內(nèi)，使腦內(nèi)5-HT濃度升高，使肌體出現(xiàn)疲勞。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明經(jīng)過力竭游泳訓(xùn)練的雄性大鼠的紋狀神經(jīng)元內(nèi)5-HT陽性反應(yīng)物大量增多。提示，運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)大鼠的伏核神經(jīng)元內(nèi)5-HT陽性反有一定的影響、根據(jù)這一結(jié)果，我們推測，經(jīng)力竭游泳訓(xùn)練后軀體運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)性顯著增強(qiáng)，除了與肌肉的張力有關(guān)外，與神經(jīng)遞質(zhì)功能增強(qiáng)有一定關(guān)系［4］。5-HT可以作為力竭訓(xùn)練強(qiáng)度的檢測指標(biāo)。

［1］Femandez-Espejo E.How does the nucleus accumbens function.Rev Neurol，2000，30:845-849.

［2］朱全，浦鈞宗.大鼠游泳訓(xùn)練在運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，1996，15(10):125.

［3］鄒慧莉，趙廣宇宿長軍，等.快速眼動(dòng)睡眠剝奪對(duì)中樞5-羥色胺缺失小鼠orexin陽性神經(jīng)元活性的影響.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2009，25(3):312-316.

［4］Andersen P.Pathwag of postsgnaptic inhibition in the hipp ocanpus.Neurophgsiol，1964，27:608.