劉 連，徐園園，許 潔，黃厚今

(1．遵義醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，貴州 遵義 563099;2．山東省眼科研究所病理科，山東 青島266071;3．遵義醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

氟是人體生命所需的微量元素，但過量攝入氟，對(duì)機(jī)體又有強(qiáng)烈的毒性作用，正常情況下，由于機(jī)體內(nèi)存在氧化－抗氧化系統(tǒng)，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其中，抗氧化系統(tǒng)中的各種抗氧化酶，如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的存在，可將過量產(chǎn)生的自由基及時(shí)清除［1，2］。但有關(guān)氟中毒發(fā)病機(jī)制中 GSH －Px的研究，多數(shù)研究為對(duì)其進(jìn)行活性檢測，本實(shí)驗(yàn)擬從分子水平上，研究大鼠肝組織中GSH－Px的mRNA表達(dá)，并檢測大鼠肝組織中MDA的含量、GSH－Px的活性，探討其在氟中毒的發(fā)病機(jī)制中的相互關(guān)系及其作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 清潔級(jí)3周齡SD大鼠32只(中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院)。根據(jù)大鼠體重隨機(jī)分為4組，每組8只，雌雄各半，在本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室飼養(yǎng)。對(duì)照組大鼠每天定時(shí)以去離子水灌胃，實(shí)驗(yàn)組大鼠每天定時(shí)分別給予含NaF(分析純)10，20，40 mg/kg的去離子水灌胃。分別于1個(gè)月后處死;①處死大鼠前，將大鼠放入事先泡酸處理過的代謝籠，留取24 h尿液，裝入具塞聚乙烯管中，保存于－35℃冰柜中，兩周內(nèi)完成測定;②采集血液標(biāo)本:置于具塞聚乙烯管中，立即離心 6000 r/min，10 min，取血清，保存于－35℃冰柜中，待測血氟濃度;③肝臟組織制備:制成10%的組織勻漿，分別保存于－35℃及－80℃冰柜中，待測 MDA含量、GSH－Px的活性及GSH－Px的mRNA的表達(dá)。

1．2 方法

1．2．1 參照《血清中氟化物的測定－離子選擇電極法標(biāo)準(zhǔn)(WS/T 212－2001)》檢測血氟濃度。

1．2．2 參照《尿中氟化物測定－離子選擇電極法標(biāo)準(zhǔn)(WS/T 89－1996)》檢測尿氟濃度。

1．2．3 MDA采用硫代巴比妥酸(TAB)法檢測，GSH－Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1．2．4 GSH－Px的mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR)技術(shù)進(jìn)行檢測，SYBRPrimeScriptTMRT－PCR Kit試劑盒購于TaKaRa公司。用于擴(kuò)增GSH－Px的mRNA的引物序列為:上游:5’－CCGGGACTACACCGAAATGAA －3’，下游:5’－CACCGGGTCGGACATACTTG－3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為882bp。參照物為β－actin:上游引物為5’－ACCAACTGGGACGATATGGA－3’，下游引物為5－CAGTGAGGCCAGGATAGAGC－3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為819 bp。40個(gè)循環(huán)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，各組數(shù)據(jù)用軟件方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，并作方差分析。

2 結(jié)果

各組大鼠血氟、尿氟含量、肝組織MDA、GSH－Px的活性及其mRNA的表達(dá)(見表1)。

隨染氟劑量的增加，1月后各劑量組大鼠血氟濃度相應(yīng)增加，存在劑量－效應(yīng)關(guān)系(r=0.884，P＜0.01)，但各劑量組間血氟濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各劑量組大鼠尿氟濃度相應(yīng)增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，存在劑量－效應(yīng)關(guān)系(r=0.921，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各劑量組大鼠肝組織MDA含量升高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，存在劑量 －效應(yīng)關(guān)系(r=0.797，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各劑量組大鼠肝組織GSH－Px的活性下降，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，存在劑量－效應(yīng)關(guān)系(r=－0.912，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;各劑量組大鼠肝組織GSH－Px的mRNA表達(dá)下降，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，存在劑量 －效應(yīng)關(guān)系(r= －0.909，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠血氟、尿氟含量，肝組織中MDA、GSH－Px的活性及其mRNA的表達(dá)(x ± s，n=8)

3 討論

血氟、尿氟水平的高低是直接反應(yīng)機(jī)體以外環(huán)境攝入氟含量多少的客觀指標(biāo)［3，4］。本實(shí)驗(yàn)中，血氟及尿氟的濃度均隨攝入氟化鈉的量變化而變化，且血氟、尿氟濃度同飲水氟濃度間有具有良好的線性關(guān)系。該結(jié)果很好地顯示了，隨染氟劑量的增加，大鼠體內(nèi)的氟負(fù)荷也在相應(yīng)增加。

目前已公認(rèn)GSH－Px在細(xì)胞內(nèi)能清除過氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈鎖反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用［5］。因此，GSH－Px活性的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，而本實(shí)驗(yàn)不僅檢測到肝組織中GSHPx的活性下降，還從分子水平的基礎(chǔ)上檢測到肝組織中GSH－Px的mRNA的表達(dá)也相應(yīng)降低。提示隨染氟濃度的增高，機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的能力也在相應(yīng)降低，也就是說機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)失衡，將導(dǎo)致自由基在體內(nèi)大量堆積，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，其產(chǎn)物 MDA會(huì)增加。因此，MDA含量的高低間接反映了機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［6，7］。而本實(shí)驗(yàn)中，各劑量組大鼠肝組織 MDA含量升高，并存在劑量－效應(yīng)關(guān)系，提示隨染氟劑量的增高，機(jī)體受自由基攻擊的程度也越嚴(yán)重，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加重。

以上結(jié)果提示，氟中毒的發(fā)病機(jī)制可能是氟中毒引起了機(jī)體內(nèi)自由基的大量增多，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化系統(tǒng)失衡，即GSH－Px活性及其mRNA的表達(dá)也相應(yīng)降低，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加重，因此，其產(chǎn)物MDA也會(huì)相應(yīng)增加。

［1］Q Chen，Z Wang，Y Xiong，et，al．Selenium increases expression of HSP70 and antioxidant enzymes to lessen oxidative damage in Fincoal－ type fluorosis［J］．J Toxicol Sci，2009，34(4):399 －405．

［2］黃勛，徐輝碧．硒的化學(xué)、生物化學(xué)及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用［M］．武漢:華中科技大學(xué)出版社，2009，145．

［3］萬桂敏，莫志亞，劉忠杰，等．地方性氟中毒患者多項(xiàng)檢驗(yàn)指標(biāo)的測定及分析［J］．中國地方病學(xué)雜志，2001;20(2):137－139．

［4］涂俊，劉克儉，李明峰，等．職業(yè)性氟接觸人群血氟、尿氟水平及相關(guān)因素研究［J］．中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2010，23(3):163 －165．

［5］Bouaziz H，Croute F，Boudawara T，et al．Oxidative stress induced by fluoride in adult mice and their suckling pups［J］．Exp Toxicol Pathol，2007，58(5):339 － 349．

［6］Nigar Vardi，Hakan Parlakpinar，Asli Cetin，et al．Protective Effect ofβ－Carotene on Methotrexate–Induced Oxidative Liver Damage［J］．Toxicol Pathol，2010，38:592－597．

［7］Rahul Pathak，Sanvidhan G Suke，Tanzeel Ahmed，et al．Organochlorine Pesticide residue levels and oxidative stress in preterm delivery cases［J］．Human and Experimental Toxicology，May 2010，29:351 －358．