蔣 慧，劉愛(ài)東，王 暉，陳遠(yuǎn)壽，潘貴書

(1．遵義醫(yī)學(xué)院 09級(jí)生理學(xué)碩士研究生;2．遵義醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，3．遵義醫(yī)學(xué)院 07級(jí)生理學(xué)碩士研究生，貴州 遵義 563099)

酒精性心肌病(Acoholic Crdiomypathy，ACM)是因乙醇及其主要代謝產(chǎn)物乙醛對(duì)心臟直接或間接的損害造成的心肌紊亂，是一種特殊類型的擴(kuò)張型心肌病，其病理改變表現(xiàn)為心肌細(xì)胞及間質(zhì)水腫和纖維化，線粒體變性等［1］。其中腎素－血管緊張素系統(tǒng)(Renin－Angiotensin System，RAS)在ACM的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS的主要作用因子。AngⅡ通過(guò)與其特異的受體結(jié)合發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)［2，3］。病理狀態(tài)激活的 RAS可以引起高血壓、心肌肥厚、心力衰竭、血管疾病等［3］。本研究旨在探討不同劑量下食用白酒給予SD大鼠灌胃一定時(shí)間后，觀察大鼠收縮壓、左心室內(nèi)壓、血漿AngⅡ的濃度及心肌血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)的表達(dá)。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 市售遵義某酒廠生產(chǎn)的53°食用白酒，AngⅡ放射免疫試劑盒(北京生物技術(shù)研究所)，RT－PCR所需試劑(大連寶生物工程有限公司)。

1．2 主要儀器 BL－420S生物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，Eppendorf M aster－cycler Gradient(Eppendorf，德國(guó))，iCycler iQ real－ time PCR儀(BIO－RAD，美國(guó))。

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 24只清潔級(jí)雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠，體重(200±20)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物室提供(許可證號(hào):SCXK－(渝)2002008)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方法隨機(jī)分為低劑量組、高劑量組和正常對(duì)照組。低劑量和高劑量分別給予4 mL·kg－1·d－1、8 mL·kg－1·d－1的 53°食用白酒灌胃，對(duì)照組給予等體積量生理鹽水(4 mL·kg－1·d－1)灌胃。每天灌胃兩次，每次灌胃量均為當(dāng)天總灌胃量的一半，兩次灌胃間隔時(shí)間超過(guò)8 h，每3天稱一次體重，連續(xù)60 d。灌胃期間各組大鼠自由進(jìn)水、飲食自由。

1．4 大鼠血壓、左室內(nèi)壓力的測(cè)定 20%水合氯醛(4 mL·kg－1)腹腔注射麻醉動(dòng)物后，行右頸總動(dòng)脈插管，經(jīng)壓力傳感器與BL－420S生物信號(hào)處理系統(tǒng)相連，描記一段頸動(dòng)脈壓波形后，繼續(xù)行左心室插管，再描記一段左心室壓力曲線，以MFL Lab200心功能軟件計(jì)算平均頸動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、左心室內(nèi)壓(left ventricle pressureLVP)。

1．5 血漿AngⅡ的含量測(cè)定 大鼠血壓、左室內(nèi)壓力的測(cè)定后，沿腹部正中線打開腹腔，分離下腔靜脈，取2 ml血液注入抗凝管中(每管含20μl 0.30M EDTA，20μl 0.34M 8－羥基喹啉硫酸鹽，10μl 0．32M 二巰基丙醇)，再取2 ml于存有肝素的抗凝管中，分別蓋好試管上下顛倒混勻后立刻投入冰水浴中，靜置1～2 h后以2 500轉(zhuǎn)/分4℃離心7 min，分離血漿。－80℃低溫冰箱保存。采用放射免疫方法測(cè)定血漿AngⅡ含量，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。

1．6 大鼠左心室質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù) (left ventricular weight/body weight，LVW/BW)采血后，迅速開胸取出心臟，預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，清潔濾紙吸干水分，電子天平稱取左心室(含室間隔)，計(jì)算LVW/BW。

1．7 心肌組織形態(tài)學(xué)和電鏡觀察 一部分心肌組織用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織切片制作。經(jīng)脫水、透明、透蠟后進(jìn)行石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，蘇木精－伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察。另一部分心肌組織用2.5%戊二醛溶液固定，再行脫水、包埋、切片并染色后進(jìn)行透射電鏡觀察。

1．8 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌AT1 mRNA的表達(dá)心肌總RNA提取和純化按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。采用Eppendorf M aster－cycler Gradient PCR儀逆轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)iCycler iQ real－time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)為:AT1上游引物 5＇－GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA －3＇，下游引物 5＇－ CTCTTT-GATGTCACGACGATTTC－3，擴(kuò)增片段 320bp。β－actin上游引物 5＇－GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA －3＇，下游引物 5＇－ GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG－3＇，擴(kuò)增片段150bp。反應(yīng)條件:95℃ ，8 min30 s循環(huán) 1 次;95℃ 5 s，60℃ 20 s 循環(huán)40次。以Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)依次計(jì)算下列數(shù)據(jù):①平均Ct=(Ct1+Ct2)/2(重復(fù)管);②dCt=平均Ct－中間值;③基因的表達(dá)以2△(－dCt)表示;④以目的基因的表達(dá)/β－肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)對(duì)AT1 mRNA進(jìn)行相對(duì)定量。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)值變量資料經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后，滿足條件者行F檢驗(yàn)，有差異者進(jìn)一步做兩兩比較的q檢驗(yàn)(SNK檢驗(yàn))，數(shù)據(jù)采用表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠行為學(xué)比較 實(shí)驗(yàn)期間，灌胃2周時(shí)低劑量組、高劑量組大鼠行為與對(duì)照組無(wú)明顯不同。2周后高劑量組大鼠灌胃時(shí)出現(xiàn)抗拒行為，灌胃后出現(xiàn)煩躁不安、行走不穩(wěn)，癥狀持續(xù)時(shí)間隨實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行而逐漸延長(zhǎng)。低劑量組與對(duì)照組之間沒(méi)有明顯差異。

2．2 食用白酒對(duì)大鼠心功能的影響 由表1結(jié)果可見，灌胃2月后，高劑量組收縮壓(SBP)、左室內(nèi)壓(LVP)與低劑量組、對(duì)照組比較均有下降，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。低劑量組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 食用白酒對(duì)各組SBP和LVP的影響

2．3 食用白酒對(duì)大鼠左心室質(zhì)量/體質(zhì)量(LVW/BW)的影響 由表2結(jié)果可見，灌胃2個(gè)月時(shí)，高劑量組的BW、LVW及LVW/BW均略高于低劑量組、對(duì)照組，但無(wú)顯著差異(P＞0.05)。低劑量組與對(duì)照組之間比較也無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

表2 食用白酒對(duì)各組LVW/BW的影響

2．4 大鼠心肌組織HE染色結(jié)果和電鏡結(jié)果 光鏡下，低劑量組和對(duì)照組心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，高劑量組心肌細(xì)胞有部分區(qū)域空泡樣變性(見圖1)。電鏡下，高劑量組心肌細(xì)胞核水腫，部分出現(xiàn)雙核仁，有空泡樣變性，線粒體明顯腫脹，嵴斷裂，部分出現(xiàn)絮狀變，肌絲排列紊亂，出現(xiàn)大量脂滴，肌絲間可見吞噬溶酶體(見圖2)。

2．5 食用白酒對(duì)大鼠血漿AngⅡ的含量的影響灌胃2月后，低劑量組(n=8)AngⅡ含量(1310．82±133．31)pg/mL，高劑量組(n=8)AngⅡ含量(1155．90 ±286．37)pg/mL，對(duì)照組(n=8)AngⅡ含量(1234．89 ±131．38)pg/mL，各組間血漿 AngⅡ含量比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2．6 食用白酒對(duì)心肌組織AT1受體mRNA表達(dá)的影響 灌胃2月后，高劑量組AT1 mRNA表達(dá)降低，與低劑量組和對(duì)照組組比較有顯著性差異(P＜0.01)。低劑量組與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)(見表3)。

表3 食用白酒對(duì)各組大鼠心肌組織AT1 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

近幾十年來(lái)，由于生物化學(xué)、免疫組織化學(xué)特別是分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對(duì)于心血管系統(tǒng)內(nèi)分泌的研究結(jié)果證明，尚有獨(dú)立于循環(huán)RAS之外的RAS系統(tǒng)，其來(lái)源、作用機(jī)制與前者皆有不同，故稱為組織RAS系統(tǒng)。組織RAS具有雙重調(diào)節(jié)的作用，它既受自身RAS本身的調(diào)節(jié)，又受循環(huán)中的RAS的調(diào)節(jié)。在RAS系統(tǒng)中AngⅡ是起關(guān)鍵作用的效應(yīng)肽。在心臟內(nèi)，AngII既可以由循環(huán)RAS產(chǎn)生，也可以由自身RAS產(chǎn)生。AngⅡ主要通過(guò)作用于其Ⅰ型受體促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、心肌細(xì)胞肥大和心肌間質(zhì)纖維化重塑［4］。新近一些研究表明慢性酒精攝入激活 RAS，通過(guò) AngⅡ發(fā)揮心臟重構(gòu)作用［5］。

ACM主要引起以左室肥厚為主心臟擴(kuò)大，它以心肌重量增加、左室甚至全心擴(kuò)張、心室壁由早期的代償肥厚至后期的失代償變薄、左室舒張和收縮功能障礙、心力失常以及充血性心力衰竭等改變?yōu)樘卣鳎?］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:灌酒2個(gè)月，低、高劑量組大鼠的收縮壓，左室內(nèi)壓，左心室質(zhì)量/體質(zhì)量，及血漿AngⅡ與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異。光學(xué)顯微鏡下，低劑量組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，高劑量組大鼠心肌纖維排列紊亂;而電鏡下高劑量組大鼠的心肌細(xì)胞出現(xiàn)雙核，線粒體腫脹，出現(xiàn)絮狀變等變化。RT－PCR顯示高劑量組與低劑量組和對(duì)照組比較心肌中AT1受體mRNA表達(dá)明顯降低。

我們推測(cè):灌酒2個(gè)月，大鼠ACM發(fā)生在早期，盡管心肌細(xì)胞發(fā)生了超微結(jié)構(gòu)的病變，但心臟功能處于代償期，因此收縮壓，左室內(nèi)壓，左心室質(zhì)量/體質(zhì)量無(wú)明顯改變。同時(shí)檢測(cè)血漿AngⅡ含量尚無(wú)變化，有研究表明，糖尿病大鼠在糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)生10～12周時(shí)有心肌細(xì)胞增生和心肌細(xì)胞間質(zhì)膠原沉積，此時(shí)心肌局部AngII含量已明顯升高，血漿AngII也從發(fā)病3個(gè)月開始升高［7］，提示灌酒2個(gè)月，心臟功能處于代償期，尚未引起血漿AngII含量的變化，表明心臟局部RAS在ACM的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要作用，也說(shuō)明白酒對(duì)大鼠心肌的損傷，出現(xiàn)酒精性心肌病變是一個(gè)很長(zhǎng)的過(guò)程;這與飲酒的劑量和時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)系。對(duì)于高劑量組大鼠的心肌AT1受體mRNA表達(dá)明顯降低，我們推測(cè)可能是乙醇及乙醇的代謝產(chǎn)物乙醛損傷心肌，使得心肌局部分泌AngⅡ，AngⅡ濃度升高，高濃度AngⅡ負(fù)反饋抑制AT1RmRNA的表達(dá)所致，也有可能與食用白酒的其他非酒精成分有關(guān)，這有待進(jìn)一步研究。

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